概  述

 

图1: 变革性网络建模研究平台的流程和主要内容
  • A–C: 收集病人的功能性基因组数据及AD相关的临床及病理表型。

  • D: 使用多尺度嵌入式基因共表达网络分析(MEGENA),从上述数据的整合分析中找到疾病基因特征及共表达基因模块。

  • E: 随后将头部的模块投射到因果网络中,来找到疾病的主要驱动基因

  • F–H: 使用先进的模式-匹配算法去搜寻能够逆转疾病基因特征及驱动基因的候选药物

  • I-L: 通过在模型系统(hiPSC衍生神经细胞及果蝇)上开展基因干扰和药物回复实验,去证实驱动基因的疾病相关性。

 

      为了了解晚发性阿尔茨海默氏症(LOAD)的分子机制,从而在此基础上探索新型的治疗靶点,来自西奈山伊坎医学院的研究者采用上述平台开展了转化医学研究。他们对来自364个捐献者(有着不同认知及神经病理表型)四个不同大脑皮层部位的样本进行了RNA测序。在随后分析所得的多达数千种的分子变化中,作者发现受LOAD影响失调最严重的是神经基因子网络。而在排名第一的这类子网络中,ATP6V1A又是关键的调节基因。通过在iPSC-neuron和果蝇上分别使用CRISPR及RNAi技术,作者进一步完成了该基因敲除的建模工作。随后经由一系列多维度的实验评估了ATP6V1A在疾病相关过程中的作用。最后还发现,一种重定位的化合物NCH-51能够改善ATP6V1A缺失在疾病模型上造成的神经障碍和退行性表型。

 
 
 

实 验 结 果

 

这里小编主要展开图1红框内J→L步骤中,和电生理相关的研究内容。作者使用了Axion公司Maestro高通量微电极阵列系统来完成体外电生理指标的采集和分析。很好地响应了神经药物开发新世代all-in-human approach的潮流。

 

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首先,建立了ATP6V1A基因敲低的iPSC衍生NGN2神经元 (iNs) 细胞模型

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然后,在两种iNs细胞系上,分别尝试了1和2号gRNA来敲低ATP6V1A的表达,并做了电生理水平的验证 (图4 E&F) 
 

图4:分化后第21天,对照及基因敲除组神经元放电光栅图(E)及10分钟内发放数量统计(F)

 

      在Axion公司Maestro系统的48孔MEA板上,我们相应地看到了神经活动水平(包括网络发放频率和协同)的明显下降。 

 

编者按:

左图为典型的一组三个MEA孔中样本信号展示。每一行线条代表着单孔内神经网络中某个位置的神经元的发放。Maestro能够并行且单独记录该孔中16个位置的信号,映射到横轴的时间维度上,共同组成该样本的神经网络实时光栅图(图4-E)。我们可以看到目标基因敲低组细胞,在分化后第21天,其神经网络自发放频率和强度比对照组而言,都有明显降低。(但文章中并没有找到协同相关数据。)
 
将左图中单个样本光栅图在10分钟内的所有光栅数量进行求和,我们就能得到右图中的一个数据点,其数值在纵轴上以‘发放事件数量’为单位体现出来(图4-F)。对于不同的样本,在单块MEA板上,我们分别做了6-45次重复。(为促进神经元成熟,iNs分化过程中加入了人星形胶质细胞(HA)共培养, HA only作为阴性对照。)

 

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接下来,使用Aβ (0或5 μM) 处理各组样本24h后,比较各组电活动差异

图4:分化后第21天,处理组及对照神经元10 min内的发放总数的蓝白热图 (图O,发放数量从低到高以从白至蓝表示,颜色越深表示发放数量越高)和发放总数柱形图(P)。

 

      从O图左下角的热图数据及P图左侧的发放总数柱状图统计上,可以发现Ctrl组有很明显的自发电活动下降 (p<0.05, n=12) 。而这时ATP6V1A的mRNA水平几乎没有下降。另外,对ATP6V1A敲低组开展的同条件Aβ42处理,将会将神经活动抑制到极低的水平(参见图O中右下角分组及图P右侧柱状图)。

 

编者按:

上述数据能够支持AD神经病理和细胞外的Aβ沉积有关的业内共识。此外,Axion的48孔MEA板带来的较高通量,使得类似O图中的多变量平行比较实验,能在以不牺牲复孔数量的前提下得以实现。从中获得的假设(如下文),能为下一步的机理探索研究提供重要的依据。
 
Aβ沉积和ATP6V1A的表达量下降都会导致神经元自发电发放降低,但对从MEA系统上得到的并行实时数据开展比较后发现,两者间似乎存在着一个mediator,它在后续的果蝇体内类似实验中起到了更为明显的作用。
 
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最后对预测得到的药物NCH-51进行了功能验证

 

图6: 使用浓度为0或3 μM的NCH-51处理各组神经元24h后,10min内放电光栅图 (H)、放电总数蓝白热图(I)和柱形图(J),其中J图n=24。   

 

      在使用浓度为3 μM的NCH-51连续24小时处理对照组和ATP6V1A敲低的iNs细胞后,可以看到(特别是对后者而言)ATP6V1A基因的mRNA水平都会产生极大程度的恢复。而在Axion Maestro MEA系统上开展的同条件功能测试实验,得到了能与上述基因测试相呼应的结果(图6 H-J)。总体来说,NCH-51部分恢复了ATP6V1A敲低组iNs细胞的神经活动水平,具有作为神经活动激活剂的后续开发潜力。
 

编者按:

Axion MEA原始数据衍生的三种分析视图(图6 H-J),都能够鲜明地反映出同一个结论:NCH-51对于对照组神经元活动的促进作用很有限,而在ATP6V1A敲低组神经元上却有着很明显的促兴奋作用。

 

 

 

小  结  (部分)

 

      在本研究中,我们在iNs样本上证明了ATP6V1A敲低导致的特征,会高度体现在LOAD差异表达基因及以ATP6V1A为中心的亚网络中。这就表明,当无法获得活体样本时,使用hiPSC系统来模拟恶性疾病(如LOAD)会是一种很具潜力的办法。

 

      我们在iNs样本上已经证明NCH-51能够改善AD相关的表型,比如通过恢复神经活动关键调控子的表达来提高神经的电活动。但是我们目前还不知道该药物的作用机理。在未来的研究中,我们将使用小鼠和其它哺乳动物的AD模型来做更多的药物测试。