背景阅读

 

 

      缓冲溶液可以起到增加药物的溶解度、稳定性以及调节 pH值和渗透压的作用，因此被广泛用于递送包括单克隆抗体在内的可注射药物。但无论哪种注射途径（肌肉/皮下、静脉和血管内注射）的刺激都会不同程度地引起有机体的痛觉感受。除了药物本身的直接作用外，缓冲液也是诱因之一。以最常用的缓冲溶剂柠檬酸盐为例，英国国家卫生服务中心曾报告，在接受含该成分的药物注射过程中，超过60%的患者声称体验到注射部位不适。这种疼痛感会增加患者的痛苦进而降低其依从性。鉴于缓冲系统在注射药物中的广泛使用，我们迫切需要一种客观的方法，在体外对药物缓冲制剂引起的伤害感受进行量化和评估。

         

      研究表明，背根神经节（DRG）感觉神经元的过度兴奋是伤害反应发生的标志。普渡大学的杨洋实验室团队将不同成分的缓冲溶剂加入到DRG神经元培养基中，借助Maestro MEA平台监测了其放电模式的差异，进而对不同缓冲系统引起的伤害感受进行了系统评估。他们的研究成果于2021年6月发表在《Pharmaceutical Research》。

 

 

 

 

 

 

实验结果

 

 

01

柠檬酸盐缓冲系统可导致 DRG 神经元放电显著增加

 

      研究者将大鼠背根神经节 (DRG) 神经元培养在MEA板上，利用 Maestro Pro平台记录DRG的放电模式，得到平均放电率 (Hz)、簇放电频率 (Hz) 和簇放电持续时间 (ms)等参数，作为评估体外伤害性反应的指征（图 1）。

 

 

图1 MEA实验流程图

 

 

     他们选择了高浓度单克隆抗体制剂开发过程中常用的四种缓冲溶液，分别比较了添加缓冲溶剂前后神经元电生理功能的变化。（4种药物缓冲系统组分：20 mM 柠檬酸盐+200 mM NaCl（“柠檬酸盐-盐”）、20 mM 柠檬酸盐+5% 甘露醇（“柠檬酸盐-甘露醇”）、10 mM 组氨酸+150 NaCl（“组氨酸”）和 150 mM NaCl（“盐水”）。所有缓冲液均平衡至 pH 5.7。） 每个处理选择一个有代表性的孔，其放电热图如图2、光栅图如图3。可见两种含柠檬酸盐的缓冲液能够刺激样本产生更多的发放，检测到有发放信号的电极数也有明显增加（图2 A/B/E/F和图3 A/B）。组氨酸可略微增加DRG的发放频率（图2 C/G和图3 C）；而添加盐水对发放电极数量或整体放电频率没有明显影响（图 2D/H和图3D）。

 

 

图2 四种缓冲溶液加入前后DRG放电热图

 

A-D：常规培养的原代DRG对照组：

E-H：分别加入了四种缓冲溶液的处理组。

（细胞板每孔包含64个电极，按照8×8电极阵列排布。测到spike的微电极以彩色圆圈来表示，深蓝色至白色渐变对应神经元放电频率从低到高。）

图3 四种缓冲溶液加入前后DRG放电光栅图

 

      随后，他们以柱形图的形式比较了添加缓冲液后各组样本平均放电率、簇放电率和簇时长这三个参数的变化倍数（图4）。结果表明，柠檬酸盐-甘露醇处理后，上述三个参数的变化倍数（单向方差分析和 Bonferroni 校正）增加幅度最为显著；单独柠檬酸盐处理可引起上述三个参数的变化倍数轻微增加；组胺和盐水处理前后则没有显著差异。这些数据表明含有柠檬酸盐而不是组氨酸或盐水的缓冲系统有刺激 DRG增强放电的作用，意味着伤害性反应的发生。

图4 添加缓冲液前后各组神经元(A)平均放电率、(B)簇放电率和(C)簇时长这三个参数的变化倍数

      鉴于低浓度柠檬酸盐 (10 mM) 目前已经作为缓冲溶剂被用于包括人类生长激素在内的一些药剂配方中，因此研究者使用该浓度对DRG的敏感性进行了测试。(缓冲液成分：10 mM 柠檬酸盐+ 150 mM NaCl (低柠檬盐）、10 mM柠檬酸盐+5%甘露醇（低柠檬酸-甘露醇）。所有缓冲液均平衡至 pH 5.7。）

     他们将上述高、低浓度柠檬酸盐缓冲溶液分别加入到DRG培养基中，比较处理前后DRG三个参数（平均放电率、簇放电频率和簇放电时长）的变化倍数(图5)。与20 mM柠檬酸盐缓冲液 (蓝、红实心柱) 相比，10 mM低柠檬酸盐 (蓝、红条纹柱) 处理组各参数均有一定程度的降低。这些结果表明，柠檬酸盐浓度的降低可相应减弱缓冲溶液对DRG神经元的伤害性反应。

图5  高、低浓度柠檬酸盐缓冲液处理前后各组样本(A)平均放电率、(B)簇放电率和(C)簇时长这三个参数的变化倍数

      Maestro MEA 是一种相对高通量的细胞外场电位记录系统。它能够以非侵入性的方式，在生理相关条件下实现对DRG神经元电活动的连续监测，从而为伤害感受提供了合适的研究平台。在本文中，研究者在体外培养了原代大鼠DRG感觉神经元用于构建伤害性感受模型。Maestro MEA检测结果发现，高浓度柠檬酸盐成分缓冲溶剂的添加可导致DRG感觉神经元的电活动增强，引发伤害性反应；而降低柠檬酸盐的浓度可减少对神经元的放电刺激，缓解上述现象。该方法同样适用于测试药物缓冲制剂温度、pH 值和其他化学因素对DRG的影响，在筛选最佳药物制剂配方方面发挥其价值。研究者还可将筛选结果与全细胞膜片钳的数据进行比对，为后续动物模型或临床试验提供详细的药效学依据。

MEA实验方法

      选择野生型SpragueDawley 幼年大鼠(7-17天) 的原代背根神经节(DRG) 用于 MEA 实验。按照神经元 8000 个/孔的密度接种在聚赖氨酸和层粘连蛋白包被的 12 孔 MEA 板（64电极/孔）上，并在 37°C 和 5% CO₂ 环境中孵育四天。种板后第二天对培养基进行半换液（去除 125 μL DRG 培养基并添加 125 μL NbActiv4记录培养基（BrainBits, Springfield, IL, USA）），然后在第四天开始记录电活动。

      首先记录基线(神经元+培养基250 μL)两分钟。然后添加 200 μL 测试缓冲液并记录两分钟（缓冲数据从加入缓冲液后 30 秒开始收集），最后加入 200 μL 1.0 μM 辣椒素（终浓度为 0.3 μM）并记录两分钟。辣椒素作为阳性对照以诱导神经元放电，来确认记录电极周围存在活跃的神经元。

      使用AxIS Navigator 2.0.4 和NeuralMetric Tool 2.4（Axion BioSystems）进行记录和分析原始数据。在实验过程中检测到≥2个spikes（>噪音的6倍标准差的信号定义为一个spike）的电极被定义为活跃电极。如果基线、加入缓冲液或辣椒素后均没有检测≥2个spikes，则判定该电极未检测到可靠信号，在数据分析中会将其移除。平均下来每孔样本活跃电极数占孔内电极总数的55%。实验中，总共对来自20只动物的原代DRG神经元进行了数据记录。分析的参数有平均放电率 (Hz)、簇放电率（100毫秒内≥ 5 spikes）和簇放电持续时长。每个电极测得参数的倍数变化计算公式: 1+buffer/1+baseline，(分子分母都加1是为了确保非零分母)，进而计算每种处理条件的平均倍数变化。