UCSD药学院的Alysson Moutri教授实验室，利用病人来源的样本获得了皮层类器官，并成功地在体外环境下重现了局灶性脑皮质发育不良（下文中简称FCD）这种疾病的一些典型特征，从而为神经发育的研究打开了全新认知的窗口。
 

 

 

 

研究综述

 

 

异常的神经发育和组成，是FCD这种先天脑部疾病的特征。其导致的局灶性癫痫发作在儿童及成人患者身上都很难治愈，所以大家都在迫切地呼吁新的治疗方案。但由于一直以来缺少一种在体外能够稳定地重现神经发育过程中FCD发作的模型，科学家们的研究进展很有限。
 
在本文中，研究者获得了源于病人iPSC的皮层类器官FCD模型。这种样本具有该疾病的一系列特征。后续实验结果表明：连接蛋白表达的改变或许扰乱了胶质细胞的发育并阻碍了神经祖细胞的成熟，从而导致神经网络的异常。
 
为了能够在这种功能性类器官中检视到神经网络活动，研究者使用到了Axion公司的微电极阵列系统-Maestro。从该实验平台上获得的数据表明，FCD皮层类器官具有异常的神经兴奋性及更多的网络连接。这和FCD疾病个体的临床表型有相似之处。结合从其它实验平台上得出的结果，我们可以说将皮层类器官作为FCD研究模型是可行的，这种思路还能够为早期大脑发育的研究提供新的视角。对于那些罹患FCD的病人来说，神经类器官或许有助于科研人员寻找新型治疗方案的努力，这不啻于是一种福音。这些成果最终发表在了Brain（IF:13.5）上。
 

 

 

 

 

MEA实验设计

 
 
 
1. 样本
使用到的四个FCD type II病人的样本，均来自于UNICAMP医院的皮肤科医生在无菌环境下完成的病人皮肤活检。我们为每个实验对象准备了10个iPSC克隆，并从中抽选了3个用于进一步的干细胞表型验证，以排除染色体异常和突变等不符合实验要求的可能性。另外，我们还构建了包含四个样本的iPSC对照系，样本来源是Moutri实验室的iPSC细胞库。和皮层类器官相关的操作还是遵循之前发表过的实验流程。
 
2. 记录方案
在12孔的微电极阵列板上，我们以每孔2-3个样本的密度将45天龄的皮层类器官接种到板上。然后在Maestro主机上，对FCD及对照样本开展不同发育阶段（50-80天及80-110天）下的自发电信号记录。频率为每周一次，每次记录时长为3分钟。对每个实验对象完成两次独立的上述实验，且每次实验的每个样本都做了双重复。
 
3. 软件及关键参数
Maestro系统自带的Neural Metric Tool：量化神经网络活动
 
软件涉及的参数：簇放电数量、网络簇放电数量、同步性指数、发放数量及平均发放频率
 
MATLAB功能及脚本（参照2021年Puppo et al.文献）：第三方软件，从Maestro上得到的原始数据中，推断有效的神经连接
 
 

MEA实验结果

 
 

 
B-E图中的每一个数据点代表了从整板内单孔中的微电极阵列（共64个电极）上采集到的不同参数的数值。在两个时长相同的发育时期内，按照一周的间隔，分别开展了5次采样。在发育的第80-110天中，和对照组比较后，我们可以发现FCD病人的脑类器官在四个参数上的数值都来得更高。
 

F图中的四幅图片，分别呈现了WT83对照及病人F1皮层类器官样本在50天龄（左侧）及110天龄（右侧）时的Maestro记录数据。每幅的下方为3分钟内每个电极（从上至下共64行对应64个电极）所连续记录到的神经元发放情况。每一次发放由一个线状的光栅作为代表。光栅的线条越粗代表放电数量越多。在这个视角下，我们能横向和纵向地从时间和空间两个维度，对神经元网络的发放分布和同步性做出快速的视觉判断。图片上方的波峰图纵坐标是64个电极上采集到的所有神经元发放数量叠加值。可以藉此了解整个网络的震荡规律。
 
G图下方的110天龄FCD病人皮层类器官，相对上方的对照样本而言，呈现出更多的有效连接，提示FCD样本内的神经元间有着异常活跃的互联。每幅视图中灰色区域是尺寸为1.2*1.2mm的微电极平面，黄圈代表单个电极，它们以8*8的阵列排布在这个平面的中央。黑色的箭头代表通过发放分选计算得到的类器官表层单个神经元间存在的直接及间接联系。这些活跃的神经元由黑色的小点来表示。其物理位置随机分布在以距离感应到它的那个电极为中心的50μm半径范围之内。
 
 

数据分析和讨论

 
 
在我们关注的每个发育阶段内，所有的皮层类器官都显示出电活动的增强，说明神经网络在每个阶段内都在不断发育。在第80-100天这个阶段，FCD皮层类器官在Fig.3B-D图示的三个参数的数值上，相较同期的对照组样本而言都来的更高，说明这时FCD样本的神经兴奋性增强了。而在发育早期的50-80天期间，就没有这种现象。另外，如Fig. 3E所示，在FCD皮层类器官成熟的过程中，其神经网络簇放电数量也在增加。甚至在发育早期（Fig.3F左侧图片）就表现出相较对照组而言更具结构性的网络电活动。
 
从推断出的神经元间直接及间接的连接这个角度（Fig. 3G），我们也可以了解到FCD样本的网络连接有明显的增强。这点能和从Fig. 3B-F数据中得到的结论相呼应：即FCD皮层类器官具有超兴奋及协同的神经网络电活动表型。
 
在早期神经网络形成过程中，神经元所发展出的主要兴奋性形式会受到突触连接的调控，而后者又是由许多遗传因素所决定的。我们的实验结果表明FCD脑类器官所显现的这种兴奋性已经超过了正常的阈值。其内部的神经元存在超连接且信号传播能力也更为强大。结合在光刺激下的3D信号记录实验中的发现，我们证明基于FCD脑类器官的研究结果能够很好地呼应在临床上常见的发生在癫痫病人身上的那些典型症状，比如较常人而言更为迅速且传播更快的脑电发放。在这种体外模型上，我们还发现FCD所导致的异常神经元连接是受神经元形态异常所影响的。还有一种遗传背景未知的因素，也促成了易发展成为癫痫网络的神经环路。
 

 

-END-

 

 

-获取原文-

 

感谢您的关注，请扫描下方二维码，我们的工作人员会将该研究PDF文件发给您。

 

 

 

 

 

 

版权所有© Axion BioSystems 亚太地区总部