综述

缺血性脑卒中在病理上的特征包含：组织酸中毒、持续的钙离子流入及进行性细胞死亡。比如说，在疾病所致的大脑缺血部位中，ATP水解所产生的质子通常会导致胞内pH值降低到6.5-6.0区间的水平。

对于脑卒中治疗方案的研究，以前都聚焦在NMDA受体的阻断。由于这个思路一直没能形成可以转化至临床的成果，人们开始考虑在中风后的持续损伤中，是不是还存在NMDA之外的疾病机理。

我们在之前的相关研究中，发现由质子介导激活的TRPV3（一种钙离子通透的阳离子瞬时受体电位香草酸亚型3通道）会造成钙内流超载，并导致细胞死亡。而且这个通道在人的大脑、脊髓和背根神经节中都有大量表达。

基于上述的认知，我们提出了这个假设：脑缺血期间发生的大脑组织酸中毒造成的胞内质子含量上升，会触发TRPV3通道的过度激活；从而在缺血性损伤发生后，造成细胞内部钙过载及进行性细胞死亡。

为了验证这个假设，我们基于tMCAO（大脑中动脉短暂阻塞再灌注）小鼠模型，研究了该通道在大脑缺血/再灌注损伤（I/R injury）发病机制中的作用。首先，在上述的I/R injury小鼠模型中，TRPV3的表达是上调的。而如果沉默该通道的表达，那么样本的神经元自发兴奋性及兴奋性突触传递就会相应降低，该模型的I/R injury也会得到改善。相反地，（小鼠模型中）TRPV3的过量表达或者沉默后的再表达就会造成神经兴奋性及其突触传导的增强，样本的I/R injury会变得更严重。然后，我们还验证了药物作用对TRPV3功能的影响。天然连翘酯苷B作为TRPV3的特异性抑制剂，的确能够起到抑制神经兴奋性及改善I/R injury症状的作用。

综上所述，我们的研究第一次揭示了在中风后的进行性细胞死亡中，神经细胞TRPV3通道扮演了罪魁祸首的角色。并且发现了阻断过度活跃的TRPV3通道或许具有缺血性脑损伤治疗方案的潜质。这些成果最终发表在了Acta Pharmaceutica Sinica B (IF 11.4)上。

 

药物作用MEA验证实验

从藏药‘独一味’这种植物中能获得连翘酯苷B这种天然的TRPV3抑制剂。它可以对由50 mmol/L的2-APB所激活的TRPV3电流产生特异性抑制，IC50浓度为6.7 mmol/L。在这个浓度下，翘酯苷B对于其它的温度敏感瞬时电位通道（如hTRPA1, hTRPV1和hTRPV457）并无明显的抑制作用。

（为了验证该抑制剂对于神经元功能的抑制作用）我们在MEA实验中，记录了小鼠原代皮层神经元在连翘酯苷B作用下的电生理信号。数据在下方的图6A-B及S5A-D中。经过数据分析，我们发现100 mmol/L的连翘酯苷B能降低神经元在发放、簇放电频率及同步性指数这些方面的电生理水平。

1.实验设计

样本-从新生C57BL/6J小鼠（出生24小时内）上急性分离得到的皮层神经元。

种板-将悬浮在8mL的培养基中的神经元（约为7*10^4个）直接种板到Axion公司提供的12孔微电极阵列板内。板底预先用poly-D-lysine (40mg/mL)/laminin (20 mg/mL)进行包被。

重复-每次实验至少使用7-13个复孔的数据进行统计计算，即每次记录的电极总数为448-832个。

记录-在FB（在样本培养基中的浓度为100 mmol/L）加入之前和之后，分别连续记录30分钟及60分钟。

采样-将原始数据分割为数个时长5分钟的连续片段，然后对每个片段计算单参数的平均值，其中数值最低的那个被用作最后的分析。

分析-使用到了Axion公司的AxIS2.1及Nex Technologies公司的NeuroExplorer软件进行MEA数据分析。

参数-使用多参数对神经元及神经网络的活动进行评估。包括发放频率、簇放电频率、网络簇放电频率及同步性指数。

2.实验数据及分析

图6-A：从单个电极上记录到的小鼠原代皮层神经元的原始发放信号，及以柱状图形式体现的平均放电频率比值（以control组第一次记录的值为参照，黑色柱代表对照组，蓝色代表处理组）。

左侧图例展示了对照组和处理组的典型自发放电特征，结合右侧的柱状图，可以发现两者之间在振幅和发放密度方面的差异很小；左图下方为100 mmol/L的FB处理后，在同样条件下（时长为0.5秒）对同样的样本开展的信号记录结果。原始信号和发放频率统计柱状图都明确提示了药物处理所导致的发放数减少现象。

图6-B：切换到发放频率热图显示模式，再来从单孔中整个微电极阵列所记录到的神经网络活动视角进行药物作用的分析。

图示的比例尺范围对应0和50Hz两个频率极限值，并由深蓝色过渡到深红色做出视觉指示。将每个电极在某个时间点记录到其周边神经元的发放频率色调，按照电极在阵列中的物理位置进行排列，就能以左侧的单孔阵列神经元活动热图来反映出网络的电活跃程度。通过对单孔内样本的单电极簇放电频率这个参数进行计算并在样本间开展比较，我们就能得到右侧的柱状图。

从上述的结果中，我们推断出无论对于神经元还是神经网络而言，FB的作用都会显著降低其发放频率，从而抑制样本的电活跃程度。

图A中的处理物质为FB的溶剂，图B为使用同一溶剂溶解后的FB处理结果。这样的实验设计能判断并消除溶剂本身可能带来的影响。这里，我们可以大致判断出，FB处理后的神经网络活动更趋于‘平静’；而溶剂却没有这样的作用。

C和D图采用了网络簇放电频率和同步性指数这两个关键参数，来具体分析图A和B中记录到的数据。每组数据来自于7-9个MEA复孔。可以看出，相对FB处理所导致的明显降幅而言，溶剂本身的影响很小。这和光栅图上的视觉判断结果一致。

小编按：Axion公司的Maestro高通量微电极阵列系统，为研究人员快速开展体外药效验证提供了有效且易用的工具。再结合单细胞膜片钳、脑梗塞体积测量、神经学评分、神经活力测定等实验得到的数据和结论，作者推断出：TRPV3的药物抑制，可以降低神经超兴奋性并缓解缺血性脑损伤。

结论

本研究的数据证实，TRPV3通道的过度表达会增加神经元的兴奋性，从而导致它们更容易在缺血性损伤发生时产生兴奋性毒性或者死亡，活体的神经功能缺损评分也因此变得更差。这是一种独立于NMDA介导的细胞毒性之外的机制。在意识到TRPV3作为药物靶点具有诱人的临床潜力后，我们进一步筛选并识别出FB这种天然的化合物。通过一系列实验，证实了它具有降低神经元兴奋性和改善缺血损伤的作用。所以，通过药物抑制TRPV3在缺血损伤中的过度兴奋性，有可能成为缺血性脑卒中的有效预防和治疗手段。