Maestro MEA检测及分析

 
 

 

      研究者使用Maestro MEA设备测定了对照 (WT) 及病人组 (NS) 类脑器官电活动。在分化第 62 天,3个病人组样本在10min内放电总数明显低于WT组。SHP2 抑制剂PHPS1的加入则明显改善了NS-类脑器官的自发放电总数和放电频率(图6A, B, C)。

 

图6 WT及NS来源iPSC衍生类脑器官电活动比较

A: 上述样本加入PHPS1之前(上图)和之后(下图)光栅图

B&C:PHPS1处理前后单位时间内放电总数(B)和放电频率(C)柱形图

 

 

 
 

背 景 介 绍

 
 

 

      Noonan综合征 (NS) 是一种常染色体遗传性疾病。患者临床特征表现为特殊面容、身材矮小、胸廓畸形、心脏功能异常和多种神经认知功能障碍。研究发现,NS是由基因突变引起,其中编码Src同源酪氨酸磷酸酶2 (SHP2) 基因的8号外显子PTPN11突变在NS患者中最常见。尽管NS患者的神经系统功能存在多种异常表现,但SHP2突变如何导致神经功能障碍的潜在机制仍不清楚。


 

 
 

结果及结论

 
 

 

      来自韩国科学技术院的研究者提取三名SHP2基因突变的NS患者真皮成纤维细胞重编程至NS-iPSC,然后采用两种不同的方法在体外分别诱导分化出2D神经元和3D类脑器官样本。他们的检测结果发现,NS-iPSCs样本在类胚体 (EBs) 的形成和神经花环 (NRs)阶段表现出形态异常和关键基因表达量的下降。而通过抑制骨形成蛋白和转化生长因子β (BMP-TGFβ) 信号通路,有缺陷的NS-EBs的发育能力可以被修复并进一步发育成神经前体细胞 (NPC) 。

 

 

      在将NPC诱导分化成神经元的过程中,研究者在NS衍生神经元样本检测到了丰富的胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)的表达。反映出病人来源样本中胶质细胞数量远高于WT组 ,说明SHP2突变有促进NPC向成熟胶质细胞分化的趋势。进一步的检测发现,相较于WT-神经元,由NS-NPC诱导分化成的2D神经元的轴突和树突长度更短。使用 SHP2 抑制剂PHPS1处理NS-神经元后,GFAP的表达被抑制,轴突和树突的长度也恢复到与WT组相当的水平。功能分析也表明病人来源的样本单位时间内检测到的发放数量也明显低于对照组。在诱导分化的第12 周,PHPS1处理NS-神经元也可以促进其中一例样本平均放电率的增加。最后,研究者在NS类脑器官样本中也检测到SHP2引起的胶质细胞增生。类脑器官的电生理功能分析也取得与2D样本基本一致的结果(图6)。 

 

 

      上述结果共同证明了在神经发育过程中,携带SHP2突变的NS病人来源iPSC衍生的2D神经元和类脑器官存在各种神经发育异常(神经胶质细胞增加、神经突缩短和细胞外神经活动减少)。抑制SHP2可以在体外神经挽救 NS 神经细胞和 NS 类脑器官中的这些异常表型,为Noonan综合征的治疗提供了一个备选的治疗思路。

 

 

 

MEA实验条件:

 

使用了Maestro Edge系统(Axion BioSystems)记录类脑器官电活动。具体步骤如下:

  • 首先使用0.05%聚乙烯亚胺(PEI,Sigma Aldrich)包被24孔MEA板(16个电极阵列/孔),然后再用15μg/ ml PLO和2μg/ ml层粘连蛋白再次包被过夜。

  • Accutase解离类脑器官15分钟。

  • 后以100,000个/孔密度接种在包被好的MEA板上,继续培养3至4周后上机记录类脑器官自发电活动。

  • 在37°C,5%CO2条件下,每30分钟使用Axion Integrated Studio(AxIS 2.1)记录10min原始数据。为了将假阳性spike和漏检率降至最低,将spike检测阈值设置为6x SD。导出的spike count文件用于计算放电总数和平均放电率。光栅图则由Neural Metric Tool软件(Axion BioSystems)生成。