综  述

 
      虽然先天性人巨细胞病毒(HCMV)感染已经被普遍接受为神经发育缺陷的主要原因,但是它的发病机理却鲜为人知。主要的挑战之一在于CMV的物种特异性,导致我们无法使用动物模型来直接研究HCMV导致的异常人类大脑发育缺陷。
      在本文的工作中,我们发现将‘类临床’HCMV毒株感染hiPSC衍生类脑器官,会导致样本生长受阻、皮层形成障碍以及钙信号和神经网络活动的异常。另外,我们还证实了能够识别HCMV五聚体复合物的中和抗体(Nabs)有防止上述类脑器官发育损伤的作用。
 

实 验 设 计

 
      当类脑器官开始分化45天时,取出部分样本,以每孔3个的密度,种到12孔的透明板底MEA板中。神经元发放检测限设定为单个电极噪音DV值的5.5倍。检测时,先将MEA板置于Maestro主机内静置5分钟,然后对每块板做连续10分钟的记录。当电极记录到的神经元放电频率达到5个发放/分钟时,该电极即被判定为活动电极。每个电极的簇放电参数计算采用自适应泊松算法。而单孔内样本的网络簇放电活动则使用非适应算法,最低的判定标准为(每个电极)至少有10个间隔不超过100ms的发放。所有MEA数据的分析,都使用了Axion BioSystems公司的NeuralMetrics工具软件。
 

MEA 数 据

 

1)类器官建模及质控

 

上图中的MEA实验结果证明:类脑器官形成的神经网络,有着自发且同步的神经元发放和簇放电(A和B图的左侧部分);右侧的药理学实验*则说明CNQX(谷氨酸能神经元抑制剂)能够几乎完全抑制这种神经活动,而bicuculline(GABA能神经抑制剂)则无类似作用。

*10mM的CNQX或者10mM的bicuculline加入到样本孔后,立即开始MEA电信号记录。

 

 

2)模拟病毒感染及测试抗体效用

 

HCMV感染对于类脑器官功能的影响

 

  • 分组情况:类器官诱导分化45天后,依次加入IgG抗体(C图-左)、HCMV毒株TB40/E和IgG抗体(C图-中)以及HCMV毒株TB40/E和中和抗体Nab 1B2(C图-右)。不同分组样本的MEA记录安排在病毒感染处理后的2周,记录时长为100s。(均值 ±SD, ***p < 0.001, 复孔数n = 3。进行放电同步性分析时,软件的同步窗口被设定在20ms。)MEA实验结束后,继续对样本进行了原位相差GFP荧光成像实验。

     

  • 对照组(C图-左)类脑器官的MEA分析表明,样本已经有同步发放和簇放电现象。相比之下,TB40/E感染组(C图-中)的神经网络活动(包括发放数量、平均放电率和同步指数)就明显降低了。和钙流实验中观察到的现象类似,1B2 Nab(C图-右)能够在很大程度上逆转TB40/E所导致的神经网络障碍。

     

  • 图D是针对采集到的MEA数据,选取有代表性的参数进行分析:从左到右依次为:每分钟发放数量、簇内发放数量、平均放电率和同步性参数。这些结果可以看出抗体处理后,样本的电生理表型就变得和对照组很类似了。

 

 

 

      上述实验结果共同证明了,HCMV会导致严重的神经网络活动障碍。而使用HCMV PC特异的Nab处理类脑器官样本,可以很大程度上防止这种伤害的发生。

 

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获得原文

 

 

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