在科学的海洋里，阻碍科研工作者们前进的往往不是他们天马星空的想象力，而是严苛的实验条件。
诱导多功能干细胞（iPSC）可以无限的迭代更新并分化为所有细胞类型。iPSC为新药的发现、疾病建模和细胞疗法开创了全新的思路。人源多功能干细胞（hPSCs）对体外的环境扰动及其敏感，存活率及单细胞克隆效率较低。这一问题严重制约了对hPSC的广泛研究和使用。
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加州理工大学的Kiichi Watanabe在先前的研究中发现，ROCK(Rho-associated Coiled-coil-forming protein serine/threonine Kinase)通路的抑制剂Y-27632能够改善人源胚胎干细胞（hESCs）的生存状态，抑制细胞凋亡。目前，Y-27632已经被广泛运用应用于优化人源干细胞的培养。可惜的是，Y-27632对于细胞活力及生存率提升有限，我们仍然需要找寻更高效的方法来解决这个问题。
2021年5月初，NIH的陈宁博士等在Nature Methods发表的A versatile polypharmacology platform promotescytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells首次发现了一个小分子鸡尾酒配方CEPT（Chroman-1，Emricasan，Polyamines 和Trans-ISRIB），能够同时阻滞多个跟细胞凋亡相关的信号通路。相比较Y-27632，CEPT能够显著的提升hPSCs在冻存复苏(Cryopreservation)和单细胞克隆(Single-Cell Clone)过程中的存活率。这将有助于促进hPSC在疾病治疗和再生医学治疗等领域的大规模培养和使用。
1. 药物筛选
陈宁博士团队首先建立了一种高通量细胞存活筛选体系(Cell-surivival assay qHTS) ，通过CTG(CELL TITER-GLO)发光法评估15, 333种化合物对细胞活力的影响，发现总共有113种类型能够提高细胞存活率。而其中Chroman 1对ROCK通路比Y-27632具有更好的抑制效果和选择性。随后，作者从113个活性化合物中，挑选了29个作用不同靶点的化合物进行了组合小分子基质筛选(Combinatorial small-molecule matrix screening)，发现Chroman 1与Caspase阻滞剂Emricasan有显著的协同作用。Caspase的检测结果显示，Chroman1和Emricasan（下文简称C+E）的联合使用可以减少hPSCs的凋亡。
根据之前的研究结果，针对C+E组合，与剩下的活性化合物进行干细胞存活二级组合筛选，发现C+E与Trans-ISRIB和Polyamines组合会有更优的效果，更高的关联度。
至此，CEPT组合横空出世。接下来我们将要面对一个重要的问题，人源胚胎干细胞的冻存复苏、生长、增殖和分化是一个动态的过程。而常用的细胞活力检测手段如CTG、MTT等，有需要添加标记物、也不能实现长时间动态测量的局限性，那该如何高效地去评估CEPT的作用呢？
2. CEPT促进细胞贴壁活力
在这里，作者选择了来自Axion BioSystems的高通量细胞活力检测系统Maestro Z（图1a）来比较细胞贴壁能力的差异。图1b结果显示，相同数量的hPSC增殖进入平台期后，CEPT 处理组具有最高的阻抗值。也就是说其平台期的细胞数量相对Y-27632 组和Chroman 1 组来说要多60%和30%左右。
图1 a)Axion CytoView-Z 96孔阻抗板及高通量细胞活力检测系统Maestro Z/ZHT展示
b)基于长时间阻抗记录评估CEPT等药物对于细胞贴壁活力的不同影响。生物学重复: CEPT组n=7，其他组n=6
3. CEPT改善冻存复苏后心肌细胞电活动
冻存的iPSC-CMs复苏后种在MEA板上，五天后使用Axion BioSystems的高通量微电极阵列系统Maestro MEA对其电活动进行评估。相比较DMSO对照组，CEPT处理组活跃电极数及Spike振幅分别增加了约100%（图2i-k）。说明CEPT在提高hSPCs细胞增殖活力及数量的同时，还能改善其分化后心肌细胞的电生理功能。
编者按：基于Maestro MEA的高密度电极阵列，作者得以通过数据的质控来定义活跃电极（本文为spike amplitude ≥300μV），从而极大地提高了MEA实验的准确度和可重复性。
图2 i)iPSC-CMs经Y-27632和CEPT等分别处理后，使用Maestro MEA系统记录的动作电位发放幅度热图
j)不同处理组活跃电极数量
k)不同处理组动作电位发放幅度均值统计
4. CEPT改善冻存复苏后运动神经元电活动
iPSC诱导的运动神经元经CEPT、Y-27632等孵育24h后，置于Maestro MEA设备进行电活动检测。相较于DMSO组和Y-27632组，经过CEPT处理的运动神经元簇内spike均值分别增加63%和98%（图3a&b）。说明CEPT也可显著增强iPSC衍生神经元的电活动。
图3 a)使用Y-27632和CEPT等处理解冻7天后的运动神经元。Maestro MEA记录下分组样本的动作电位发放幅度，以热图视角呈现出来。
b)不同处理组平均簇发放spike数量统计
上述实验结果证实CEPT能够显著地提升hPSCs在冻存复苏和单细胞克隆过程中的存活率。CEPT未来可应用于普通细胞系传代、诱导干细胞生成、类器官形成、EB形成、干细胞基因编辑、单细胞克隆及冻存人源胚胎干细胞的表型功能研究等方向（图4）。
编者按：在干细胞活力分析以及iPSC衍生神经元/心肌细胞的电生理功能检测应用方面，Axion公司可以提供量身定做的专业解决方案。Maestro系列离体生物电系统的诞生将有助于加快可重复的干细胞实验和临床应用的研究进程。
图4
首先使用VN包被CytoView-Z 96孔板5μg/cm²，37°C下孵育过夜。随后去除VN溶液，并向每个孔中添加100μl 2x E8培养基。将细胞板置于Maestro Z设备测量阻抗基线。
接着将Accutase加入细胞培养皿，解离10分钟后收集细胞，并使用E8培养基重悬至100,000/ml。取出CytoView-Z 板，每孔加入100ul细胞悬液进行种板（10,000个/孔）。室温下静置1小时以确保细胞均匀覆盖后，将细胞板放回Maestro Z，控制环境为37°C和5％CO2。最后，在10 kHz下连续记录阻抗值36小时。
首先使用8μl 50μg/ ml的Fibronectin包被MEA板，37°C下孵育过夜。
接着，将冻存的iPSC-CMs置于37℃水浴孵育4分钟后，转移至含有DMSO、Y-27632或CEPT的9mL培养基中轻轻混合。按照63, 000个/cm²的密度进行种板。48h后更换为常规培养基。每2-3天进行半换液处理。
最后，在种板第7天和第14天进行电生理记录。
