尽管有许多关于从 hPSCs诱导交感样神经元的报道，但还没有一种诱导方法能有效地从hPSCs分化出副交样感神经元。一般来说，每种类型的周围神经系统神经元（PNS）都是从神经嵴（NC）分化而来的。研究者将NC诱导方法进行了改良，通过调节细胞密度和神经营养因子的不同组合，可以分别诱导出交感样神经元和副交感样神经元。同时，细胞标志物分析结果表明交感样神经元早于副交感样神经元出现。随后，他们将ChR2（一种光敏感通道蛋白）转染到诱导出的神经元中，借助发光设备对样本进行蓝光刺激。Maestro MEA检测显示神经元放电的持续时间与光刺激时长相同步。（这一结果说明转染的细胞可以对蓝光做出反应，通过光遗传的方式调控神经元放电功能是可行的。）上述结果共同证明了这种新的方法可以诱导出具有功能的ANS神经元。

（图g: 在诱导52天后，给予表达ChR2的神经元蓝光刺激，跟随光刺激的时程，在Maestro MEA系统上会检测到相应时程的神经元放电，证明新方法诱导的神经元已经分化成为具有功能的ANS神经元。）

为了检验体外信号对组织功能的精确调控，研究者将这两种ANS神经元分别与人iPSC来源的心肌细胞共同培养在MEA板内。用蓝光或尼古丁刺激表达ChR2的交感样神经细胞时，Maestro MEA检测显示心肌细胞心率显著增加。而使用尼古丁刺激副交感样神经细胞时，心率明显降低。（但是蓝光刺激未降低该样本心率，作者猜测可能是表达ChR2的副交感神经细胞相对较少的原因）。相比之下，在只培养心肌细胞的样品中，尼古丁仅引起心率的轻微变化。由此可以确定，在体外，交感或副交感神经元可以精确调控心肌细胞的跳动频率。

（图a:将诱导的交感和副交感神经元转染ChR2后，分别与心肌细胞共培养。再给予光刺激和尼古丁刺激观察心肌细胞的心率变化）

（视频展示蓝光刺激表达ChR2的hSC来源的交感样神经元使共培养的心肌细胞搏动频率增加）

（图f,蓝光刺激前后心率的倍数变化统计图，i给予刺激前，ii刺激进行中，iii刺激停止后）

（图a，使用尼古丁分别刺激交感和副交感神经元，可以使共培养的心肌细胞心率分别发生增加和减少）

MEA 实验方法：

在进行MEA实验时，先将心肌细胞种到AxionBio Systems 公司的64通道微电极阵列板上，然后用Maestro Pro高通量微电极阵列系统对自发收缩的hiPSC-CMs样本的场电位进行了记录。光遗传刺激时，先以ChR2感染神经元，一周后检测感染效率。实验通过给予蓝光刺激神经元，记录神经元放电时长。共培养系统中，交感/副交感神经元在诱导分化第13天时，直接以1:1的比例分别与心肌细胞混合培养。然后给予蓝光和尼古丁刺激，记录样本心率变化。