背 景 阅 读
Leigh综合征(Leigh syndrome, LS) 是一种罕见的、累及中枢神经系统的线粒体疾病。目前在临床上，包括LS在内的95%的罕见病尚无有效治疗方案。这是由患者基数小、无法开展大规模药物试验、不良反应风险高等因素造成的。因此科学家们迫切需要个性化的预筛选平台，在体外完成药效评估后再开展临床试验，来突破上述罕见病药物开发的瓶颈。
基于iPSCs的疾病模型给人们带来了新的希望。在本文中，来自加拿大曼尼托巴大学的研究者们报道了一位携带罕见杂合突变的类LS患者。致病基因为线粒体烯酰-辅酶A水合酶短链1（ECHS1）。他们将源自病患及健康人的iPSC分化为成纤维细胞（代表体内的一般细胞群）、神经祖细胞（NPCs）和成熟的神经元以及心肌细胞，进行了一系列表型及功能分析。包括使用Maestro高通量微电极阵列平台，对上述最后两种样本在不同处理条件下功能差异的分析。最终确定了ECHS1突变的致病性。
接下来，他们在此基础上开发了一个多系统的药物安全和疗效评估平台，基于单个病人的 样本，从7个化合物中筛选出了3种个性化候选药物。后续三年的临床治疗效果显示，该患者病情稳定，没有恶化的迹象。经代谢组学分析，其代谢产物与健康对照非常接近。因此，这种个性化平台能够帮助研究人员对一些重要的问题做出更好的决策。比如是否要建议某个超罕见疾病患者去参与潜在治疗方法的临床试验等。这一成果被发表在2022年4月《Science Advances》(IF 14.1)上。
部 分 研 究 成 果 总 结
iPSC衍生细胞表型及功能分析
除ECHS1突变的类LS患者外，研究者还选取了一位健康人和一位典型LS病人分别作为阴性和阳性对照。在ATP水平、线粒体膜电位和基础有氧呼吸速率等指标上，所有源自于患者的各种细胞都要显著低于正常组，而ROS值则会来的更高。此外，两个患者来源的iPSC衍生心肌和神经元细胞中乳酸含量增加，NPCs和成纤维细胞的生长速率则均有下降。上述结果与患者们的临床表现是一致的，说明iPSC衍生细胞能够再现病人的疾病表型。随后，研究者使用转基因技术将野生型ECHS1转入类LS病人iPSC衍生成纤维细胞中，发现可有效逆转上述各细胞表型，从而验证了ECHS1突变的致病性。
许多文献报道包括LS在内的先天性线粒体疾病与神经元功能异常及心脏疾病等并发症有关，因此研究者们还借助Maestro MEA平台和钙成像技术对iPSC-Neurons/CMs进行了功能验证。iPSC-Neurons成熟后每周采集一次数据，图S6-B为三组样本平均放电率随时间变化曲线图。MEA检测结果表明，对照组神经元从第二周开始有电活动，而ECHS1患者样本则从第三周才开始放电。图C/D和E/F/G分别以柱形图和光栅图的形式显示出第6周各样本的平均放电率和簇放电率。可见两个病人组的参数值均明显低于对照组。其中，ECHS1患者组最低。这反映出ECHS1病人来源iPSC-Neurons倾向于保留神经祖细胞的表型，细胞成熟被延迟。后续的钙成像实验也验证了这一点。
图S6 Maestro MEA平台检测iPSC-Neurons电生理功能
A）在显微镜下MEA板内微电极和iPSC-Neurons图像
B）三组样本神经元成熟后，平均放电率随时间变化曲线图
C-G） 三组iPSC-Neurons诱导分化第6周平均放电率和簇放电率柱形图（C&D）以及光栅图（E/F/G）。（光栅图中黑色短线代表一次发放。5个连续的发放定义为一个簇放电，以蓝色标识。纵向的红色线框则代表网络簇放电。）
接下来，采用类似的实验设计，他们又对iPSC-CMs样本展开了功能分析。在下方的数据中，我们发现与对照组相比，两个病人组的cFPD均有所增加（图S8-B），而场电位振幅、传导速率和收缩振幅都有所下降（图S8，D至E）。这些参数的变化表明iPSC-CMs存在异常跳动和心律失常，这与钙成像的检测结果也是一致的。
图S8 Maestro MEA平台检测iPSC-CMs电生理功能
A）在显微镜下MEA板内微电极和iPSC-CMs图像
B-E）依次为三组iPSC-CMs的cFPD、场电位振幅、传导速率和收缩振幅
这种基于iPSC衍生细胞的多系统模型功能分析，进一步验证了这些样本在体外重现人类病症及被用于药物安全和有效性测试的潜力。
个性化药物安全及有效性评估
在改善线粒体功能方面，作者发现七种药物处理后，上文中描述的患者来源各个类型细胞ROS产生都明显减少。其中的四种（泛醌Ubi、硫辛酸ALA、核黄素Ribo和心磷脂过氧化物酶抑制剂Elamipretide ）在不同浓度下都能显著提升成纤维细胞的线粒体膜电位。
为了了解这四种初步筛选出来的药物对ECHS1病人iPSC-Neurons/CMs的功能影响，研究人员再次使用Maestro MEA平台开展后续评估。如图S14 A&B中的数据所示，Ubi和ALA都能有效提升神经元的平均放电率和簇放电率，改善了样本的放电功能；而Elamipretide却对神经元个体及网络活动产生了明显的抑制。而在图S16 A-D展示的四个心肌功能关键参数测试结果中，我们发现所有药物都能不同程度地降低病人样本过高的cFPD，但它们对于剩余参数的影响却不尽相同，只有ALA在改善细胞收缩和传导速率方面显得尤其有效。
图S14 Ubi、ALA、Ribo和Elamipretide 四种药物（均为10uM）处理ECHS1病人来源iPSC-Neurons7天后，平均放电率(A)和簇放电率(B)柱形图
最后，再结合钙成像实验结果综合判断，研究者认为Ubi、ALA和Ribo这三种药物在体外具备改善病人来源样本的神经和心脏电生理功能及线粒体功能。在安全和有效性方面，为上文中提到的后续个性化临床实验提供了宝贵并重要的支持。
结 论
综上所述，罕见病患者来源的iPSC衍生细胞能够在体外再现疾病表型。科学家们在此基础上开发的基于iPSC的个性化平台可以作为一个预筛选工具对候选药物开展各种测试，有助于降低后续临床人体实验风险，加快罕见病治疗进程。
MEA实验条件：
使用DMEM F12培养基按照1:100比例溶解Geltrex以后包被24孔MEA板。然后将iPSC-Neurons/CMs（均为40,000/well）种在MEA板中，均匀地覆盖孔内16个电极。细胞成熟后，将MEA板置于Maestro Edge MEA系统（Axion BioSystems ）上，使用Axis Navigator 3.5.1软件采集和分析神经元和心肌细胞的数据。神经元光栅图由Neural Metric Tool生成。心肌样本的cFPD由Cardiac Analysis Tool导出。
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