2022年6月1日，挪威科学和文学院宣布了2022年科维理奖（The Kavli Prize）获奖名单。科维理奖由美国科维理基金会、挪威科学与文学院和挪威国家教育与研究部共同设立，每两年颁发一次，以表彰全球在神经科学、天体物理学和纳米科学领域做出突出贡献的科学家，促进公众对科学家及其工作的了解并鼓励国际科研合作。今天的获奖者中有4名神经科学家，他们因发现一系列与大脑疾病背后的相关基因而获奖。

        其中，Jean-Louis Mandel教授（斯特拉斯堡大学）发现在X染色体上的异常基因突变是导致脆性X综合症（fragile X syndrome）的原因。它是自闭症最常见的遗传性病因之一。

      接下来就让小编带您再重温一下利用Maestro MEA平台对脆性X综合征开展的研究。

      脆性X染色体综合征（简称为FXS）是智障和自闭的最常见诱因。该种病人缺失正常的Fmr1基因，并表现出异常高的神经及环路兴奋性。据统计，男性及女性的FXS病人惊厥发生率分别为15%和6-8%。而在小鼠疾病模型（Fmr1 KO）中也发现了这种疾病表型。

我们知道，细胞会通过一套进化保守的机制来对内质网应激做出反应。这有助于它适应并消除外界的干扰。在之前的研究中，我们发现通过抑癌基因p53的泛素化，内质网应激反应能诱使小鼠降低惊厥易发性。

而Fmr1基因恰恰和内质网应激反应的很多信号通路相关。但是，Fmr1 KO的神经元和小鼠是否会以及怎样通过稳态调节自身的兴奋性去响应外界的刺激，在很大程度上并不为人所知。

所以我们想弄清楚的一个问题就是：是否内质网应激导致的神经及惊厥活动的下降，在Fmr1 KO小鼠中发生了改变。如果是的话，我们该怎样去纠正它。

研究成果总结

本研究的实验数据表明，内质网应激反应是通过蛋白合成依赖的机制来产生作用的。在体外细胞实验中，它能阻止神经网络同步性的增加；在体内实验中，动物的惊厥易发性也有相应的降低。而且这些现象都发生在野生型而非Fmr1 KO的小鼠样本上。从具体的机理上来解释，我们发现在Fmr1 KO神经元中诱发内质网应激后，Mdm2基因被异常沉默，并导致p53泛素化受阻。而在使用Pifithrin-α（一种p53基因抑制剂）后，就能在Fmr1 KO小鼠中恢复内质网应激所致神经网络同步性及惊厥易发性之双重降低。内质网应激能够由很多生理及病理刺激所诱发，包括在FXS疾病中发现的线粒体呼吸水平下降及异常的翻译控制等。那这些新发现的Fmr1 KO细胞缺陷，就能说明FXS病人的神经兴奋性稳态失衡可能是由于无法对上述常见的细胞应激压力做出正确的反应所致。

编者按：作者充分利用了体外实验在多重复、分组、药物作用等方面的技术优势，基于Maestro MEA平台，通过一系列逻辑缜密的实验设计，在表型建模和分子机制层面做出了重要的探索，其结果的可靠性也得到了动物活体水平相关实验的验证。这就为将来可能开展的基于人类疾病样本的研究工作奠定了扎实的基础。

在膜片钳实验中，我们发现内质网应激并不会对单细胞水平的神经兴奋性造成影响。那么如果从群体水平的神经发放同步性角度看，结果会有所不同吗？为了找到答案，我们借助于Axion公司的Maestro微电极阵列系统（配合单孔含64个电极的MEA板使用），对培养至13-14天的野生型及Fmr1 KO的小鼠原代皮层神经元，开展了对比实验。分别用DMSO及Thapsigargin（简称Tg，内质网应激诱导剂）处理上述样本一小时后，通过计算电极间同步指数（基于在上图中以光栅图呈现的原始数据），我们就能知道答案（归纳在图1柱状图中）。

可以看到，Tg处理不会对对照组样本造成大的影响，却能导致Fmr1 KO样本在同步性上的大幅增强。这个现象或许能够解释之前在Fmr1 KO小鼠上得到的实验结果：内质网应激预处理会导致惊厥发生率升高。值得注意的是，如果用60 μM CHX（cycloheximide，一种蛋白合成抑制剂）继续处理已受Tg影响的样本，那对照组的发放同步率就会出现明显上升，而Fmr1 KO组却没有这种现象。

上述实验结果表明，在急性内质网应激发生后，Fmr1是通过一种蛋白合成依赖的途径，来防止神经网络同步性升高的。

我们已经知道，Mdm2的功能是将肿瘤抑制蛋白p53泛素化从而使其失效。通过一系列蛋白水平的实验，我们证实了在经Tg处理的Fmr1 KO细胞中，发生了异常的p53蛋白泛素化水平下降，但是p53蛋白的总体水平并未受到大的影响。

为了在功能层面证实Mdm2基因的重要性，我们首先构建了一个Mdm2基因局部敲低的小鼠模型，下文中以Mdm2-cKD来表示。相比正常小鼠样本而言，当这种模型的皮层神经元细胞在体外培养到第14天时，其Mdm2基因敲低效率大概为45%。随后，我们开展了类似与上文中介绍过的Maestro实验。在图2的Mdm2-cKD 组MEA实验数据中可以观察到之前发生在Fmr1 KO样本上的类似现象：神经元网络的同步性在Tg处理后有大幅的上升。该实验说明Mdm2信号通路受损，可能参与并导致了急性内质网压力被诱发后，发生在Fmr1 KO细胞样本上的同步性异常增强现象。

3. p53抑制能够恢复急性内质网压力诱发的神经网络同步性稳态并减少惊厥活动的发生

为了进一步确认Mdm2-p53信号通路的激活障碍，是导致Fmr1 KO样本电活动异常现象的根本原因，我们设计了这个药物体外验证实验。使用到了Pifithrin-α这个公认的p53转录抑制剂，浓度为1 μM。如上面的Maestro MEA实验结果所示，加入这个药物后，我们发现它在Mdm2-cKD和Fmr1 KO样本上都能逆转Tg处理所诱发的异常电活动，图3。

随后我们又做了动物验证实验，将Tg、Pifithrin-α、生理盐水通过腹腔组合注射入不同分组的Fmr1 KO小鼠体内。三小时后，再注射红藻氨酸来诱发癫痫并记录动物行为。在那些被注射了Tg的Fmr1 KO小鼠中，Pifithrin-α的确能延长4级癫痫发作潜伏期，并延迟5级癫痫的发作。

研究结论

上述各种体外和动物实验数据表明，Fmr1经由Mdm2-p53信号通路，起到了防止神经网络同步性增高的作用，从而降低了惊厥的发生率。相较而言，Fmr1 KO在面对细胞压力时就无法做出应有的反应。这种新发现的缺陷有望被用来解释脆性X染色体综合征个体所表现出的神经兴奋性失稳现象。

如有问题，欢迎随时与我们联系

  电话: +86-021-53833169

邮箱: Iyin@axionbiointl.com

题图来源：https://www.kavliprize.org/