本文的通讯作者应明耀为美国约翰霍普金斯大学医学院教授。作为创始人之一，他还担任国典（北京）医药科技有限公司总经理和首席技术官的职务。这篇文章发表在了Molecular Neurodegeneration, IF 18.8。
1. 研究背景
对于肌萎缩侧索硬化（ALS）等与运动神经元相关的神经退行性疾病而言，hiPSC衍生的脊髓运动神经元在疾病建模及相关治疗方案的开发中，有着广泛的用途。要想获得能够准确地重现ALS在基因和表型方面复杂性的iPSC细胞疾病模型，必须得有高效的运动神经元分化策略。这种模型的重要应用之一，是帮助人们去了解药物作用的分子机制，从而弄清楚那些被FDA批准上市的ALS药物，之所以临床效果平平的原因。配合可诊断的生物标志物，机制研究中的新发现就可以被用来去优化治疗策略，从而让现有的药物起到更好的效果。
2. 研究方法
通过使用能够编码两种转录因子（Ngn2和Olig2）的合成mRNA，我们做到了在4天内诱导iPSC有效地向运动神经元分化。在大量的验证确认后，这些样本被用于研究Edaravone的神经保护效果和分子机制，从而为该药物临床疗效的改善提供线索。在这个过程中，我们开展了电生理、神经毒理以及转录分析等实验。
3. 结果
用上述的mRNA诱导策略，我们从对照、ALS iPSC以及胚胎干细胞样本中，都成功分化出了高纯的运动神经元（下文中用miMN表述）。对于这些细胞，Edaravone能够降低由过氧化氢诱导产生的神经毒性和电生理功能紊乱现象。这样的神经保护效果也同样能够在谷氨酸诱导的miMN神经毒性模型中重现。在进一步的转录组分析中，我们发现了之前未见报道的Edaravone药效：在体外和体内条件下，它都能诱导胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）受体RET的表达，并进而激活GDNF/RET神经营养信号通路。很明显，Edaravone的使用已经足够支持miMN的长期存活和成熟，能够替代之前向培养基中添加神经营养因子（BDNF和GDNF）的做法。另外，我们还证明了Edaravone和GDNF联合给药，相较于任意单一药物处理，能够更有效地去保护miMN免受过氧化氢诱导神经毒性的侵害。这也许能够成为ALS治疗的新策略。
1. 实验条件
样本：开始分化后第四天的神经元，以5 × 10^4 cells/well的密度，被接种到预先用poly-D-lysine/laminin包被的CytoView MEA 24孔微电极阵列测试板（Axion公司）上。
参数：动作电位次数统计、平均神经发放率及簇放电总数。
记录：先采集10分钟时长的电信号作为基准值。药物处理时，在加入Edaravone（10 μM）作用16小时后，再在培养基中加入过氧化氢（3 μM)，静置24小时。这时采集样本的自发动作电位各参数值，并参照基准值做归一化处理。
2. miMN样本的电生理分析
(F)明场下附着在电极上方的miMN及TTX处理前后的连续发放波形图 (G)各组miMN组每分钟发放数量
在使用膜片钳对miMN的功能化成熟做了研究后，我们再通过微电极阵列（Axion公司的Maestro系统）以高通量及连续的方式来对样本的自发神经活动做进一步监测。如图4F最左侧图示，细胞贴壁生长在微电极阵列板内时，能与在板底的电极发生接触。这样，神经元的放电行为就能被电极所记录下来。右上方图显示的是阵列中某个电极所记录到的发放波形图（来源于单个或数个神经元，当下记录到的峰颜色最深）。右下方的两幅图代表0.5 μM TTX处理前（左侧）和处理后（右侧）的神经元发放原始信号。可以看到在加药后，MEA记录不到除背景噪音（绿色条幅）之外明显的神经元放电行为了。这说明样本对药物有正常的反应。
接着，我们对不同来源的miMN样本做了组间比较。如图4G所示，在iPSC开始分化的第四天，我们将正常对照及ALS病人来源的miMN（各两组，每组3重复，共12个样本）分别种入同一块MEA板的不同孔内，并在种板后的第10、12、14、16、20、24及28天记录这些样本的自发放电行为。可以从这种长时程实时记录的数据中发现，两种miMN都在开始分化的第24天达到发放频率峰值。但是那些含有SOD1A4V突变的ALS miMN在整个成熟过程中，相较对照组而言一直呈现出更高的自发放电现象。我们从有效电极数量（参见补充数据图1D）和MEA实验结束（分化后第30天）后的细胞计数统计（都在0.8–1.3 ×10^4 per well这个范围内）这两个方面对上述数据进行了质控分析，证实了这个发现的可靠度。而且这与之前报道过的在ALS iPSC-MN样本上发现的超兴奋性表型也很一致。
编者按：Maestro MEA assay从细胞电生理功能角度，证明了体外ALS疾病建模是可行且可靠的。
3. 验证Edaravone对于神经毒性的保护作用
图5 Edaravone保护miMNs免受H2O2诱导的神经毒性
(C)不同药物处理组连续发放波形图 (D)上列分别为总发放数量、平均神经发放率及总簇放电数量的统计，下列为参照基准值归一化处理后的数据统计
过氧化氢一直被用来模拟在ALS等神经退行性疾病中发生的氧化压力和神经毒性。在3 μM这种低浓度的过氧化氢处理下，神经元不会遭受明显的破坏。在这个实验中，我们结合使用分化后第25天的健康人源miMN作为样本，来对被FDA批准用于ALS治疗的Edaravone，做细胞和分子水平的药效探索。
按照样本中是否添加了过氧化氢和Edaravone作为分组依据，每组做三重复，我们得到了图5C所示的神经元自发放电原始信号及基于其计算而得到的三种参数绝对值和归一处理后的相对值（图5D）。
首先，从上述数据中我们发现，过氧化氢能将miMN的自发放电抑制掉约70%。这可以很好地模拟神经退行性疾病发生前神经元功能的早发损伤状态。其次，Edaravone能够有效地将神经元的发放逆转到未经过氧化氢处理组的水平。而且，从后者的Edaravone处理结果上看，其自发放电的水平并未受到药物的影响。这说明Edaravone可能是通过神经保护而非提升神经活动来发挥作用的。
编者按：基于Maestro高通量微电极阵列系统获得的表型数据，用户可以对药物作用机理的类型做出合理推断。这将有助于加快后续研究的进程，并降低课题的整体研究成本。
如有问题，欢迎随时与我们联系
电话: +86-021-53833169
邮箱: Iyin@axionbiointl.com
