综述
神经及其活动产生旁分泌因子进而促进高级别神经胶质瘤的生长，正在成为除了关键的免疫系统细胞之外，人们所关注的中枢（视网膜神经节细胞即RGCs）和周围神经系统（感觉神经元及背根神经节细胞即DRGs）肿瘤进展的背后推手。本文聚焦在1型神经纤维瘤上，以期丰富上述的这类研究。原因是这些病人有进一步发展出与神经密切关联肿瘤的倾向，如视路胶质瘤（OPGs）和丛状神经纤维瘤（pNFs）。
首先，通过联合使用hiPSC及神经纤维蛋白1（下文中用NF1代表）突变的小鼠模型，我们证明了中枢和周围神经系统的神经元，会以依赖于NF1突变及神经活动的方式，分泌肿瘤进展所必需的旁泌因子去支持其生长。
在临床上，我们还常能发现一些患有1型神经纤维瘤但并不发展出视路胶质瘤或丛状神经纤维瘤的病患。他们的NF1基因包含有一种天然的错义突变(c.5425C > T; p.Arg1809Cys)。采用与上文中相同的技术路线，我们构建了包含这种特殊突变的小鼠疾病模型并与常规NF1突变小鼠模型作对比。结果和临床的发现十分类似，即这些特殊基因型的小鼠不会发展出视路胶质瘤或丛状神经纤维瘤，而且DRGs和RGCs也不会出现RAS(一种原癌基因，其基因产物增多或活性增强时，或使细胞过度增殖，从而形成肿瘤)依赖的神经超兴奋表型。（编者按：这就很好地证明了上述动物模型的临床相关性，并丰富了后续机理研究的实验对象。）
先前的研究表明NF1能够结合到超极化激活环核苷酸门控阳离子通道（即HCN通道）上，而后者能直接调控神经元的兴奋性。在本研究中，我们证明了HCN通道的失调会使NF1突变了的中枢及周围系统神经过兴奋，并进一步导致促瘤旁泌因子的释放。而如果使用抗癫痫药物lamotrigine去选择性地作用于HCN通道，我们就能在小鼠体内有效遏制NF1-视路胶质瘤的进展。
除此之外，我们也证实了促瘤的神经元NF1突变还能经由视觉体验（光线）所激发的神经活动来调控旁分泌因子的神经生成，而不仅仅是经由HCN通道失调所介导的基准神经超兴奋性。
MEA实验方法
样本：分别从WT（野生型）、NF1+/neo（NF1基因突变型）及NF1+/1809（杂合的含有Arg1809Cys错义突变的NF1基因突变型）小鼠上获得原代海马神经元、RGC及DRG神经元。至少要从来自于独立的3窝小鼠中的6只个体上采样。
种板密度：以300k cells/well、300k cells/well及150k cells/well的密度，将上述三种神经元接种到AxionBio公司的48孔微电极阵列板中，并在各自的最佳生长培养基环境中培养10天。要尽量在单个MEA孔内实现细胞的均匀分布。
重复设定：从每只小鼠上得到的每种神经元都要做三重复种板。药物处理实验中，每只NF1+/neo小鼠要至少重复6次种板。其中至少三个孔作为对照组，剩下的至少三个孔作为处理组。
采样：所有样本都在4.5倍标准差阈值设定下连续记录3分钟时长的电信号。使用到了AxionBio公司提供的AxiS 2.5.1版本的软件，数字滤波器设定在5k赫兹。所有参数都要参考‘活动电极数量’来做归一化处理。
参数1（动作电位发放频率）：在每个数据点的计算中，要对每个分组中所有复孔为期三分钟的总数值求平均，并以APs/min作为单位。
参数2（动作电位波形图）：从单个电极记录到的多个发放集合中剥离。使用到了AxionBio公司的neural metric tool软件及第三方的Offline sorter x64 version 4软件。
Axion公司的Maestro高通量微电极阵列系统，参与到了本文的多个研究结点中。在多分组、多重复、无标记且实时的条件下，它能为药物作用提供更具生理相关性且具严格质控的表型数据，并能以可视化的图形快速输出结果。为作者关于疾病机理的一系列假设，提供了重要的实验佐证。下面就简单展开一下这方面的研究内容和数据。
MEA研究结果
1.与视路胶质瘤发生相关的NF1基因突变了的中枢神经系统神经元具有超兴奋性
Fig.2 A) WT, NF1+/neo及NF1+/1809各组的发放频率统计(左, WT n=27, NF1+/neo n=15, P= 0.0012, NF1+/1809 n=4)和光栅图(右)。
从发放频率统计柱状示意图及电极阵列持续30秒记录所得的光栅图上，我们都发现只有NF1+/neo型视网膜神经节细胞具有相较野生型而言更高的电活动（2.5–3.9倍，图2A）。这都说明，与肿瘤形成相关的NF1基因突变可能是造成上述神经元细胞超兴奋的原因。
2.上述神经元以依赖于电活动的方式分泌促瘤因子
Fig.2 K) NF1+/neo的TTX组与Veh组发放频率统计(左, vehicle n=5, TTX n=7; P=0.0003)及光栅图(右) M) TTX处理后Midkine的分泌量(n=5, P =0.0046).
我们在NF1+/neo型视网膜神经节细胞培养基中加入了1 μM的TTX（tetrodotoxin，高效神经毒素）。可以从Fig. 2K的放电频率统计及连续光栅图分析中发现，处理组样本的放电频率被降低了约80倍。如果对相同样本在TTX处理后Midkine的分泌（中期因子，和肿瘤的发生发展密切相关）进行定量，则相应地会发现有1.9倍的下降（Fig. 2M）。
3.在上述神经元中，Midkine的生成是由HCN通道活动来调节的
Fig.3 D) NF1+/neo的LTR处理组与Veh组发放频率统计(左)及光栅图(右)
我们已经知道NF1+/neo型突变样本中的HCN通道表达量并未改变。那么是否是其功能上的变化导致了更高的神经元活动及后续Nlgn3/midkine的生成呢？我们使用了一种HCN通道的激动剂LTR（lamotrigine），并以200 μM的浓度将其加入到NF1+/neo型视网膜神经节细胞培养基中。通过对连续3分钟的MEA记录结果开展分析（Fig. 3D），我们发现LTR处理能造成样本在放电频率上超80%幅度的降低。
4.上述类型的神经元活动并不依赖于RAS
Fig.3 Q) NF1+/neo的IN-1处理组与Veh组发放频率统计(左)及光栅图(右)
Supplementary Fig.3 L)经过IN-1处理后的海马神经元与Veh组发放频率统计(n=4)
NF1突变后，就丧失了与RAS（一种原癌基因，其基因产物增多或活性增强时，或使细胞过度增殖，从而形成肿瘤）结合或者调节其活性的功能，导致其变得更为活跃。但是类似的情况（RAS-GTP含量上升）也同样发生在NF1+/1809型中枢神经系统神经元中。这就说明RAS失调，并非肿瘤形成与否的唯一决定因素。但同时，这个发现也并未排除RAS作为HCN通道活动下游信号通路成员存在的可能性。当我们在NF1+/neo型视网膜神经节细胞培养基中加入RAS抑制剂IN-1后，其电活动未受大的影响（Fig. 3Q）。这样的实验在小鼠的海马神经元细胞上也获得了类似的结果（Supplementary Fig. 3L）。
5.NF1基因突变（NF1+/neo型）的感觉神经元会以电活动依赖的方式，生成COL1A2
Fig.5 A)WT DRG, NF1+/neo及NF1+/1809各组的发放频率统计(左,WT,n=24, NF1+/neo, n=10; P=0.0005, NF1+/1809 n=10, ns)和光栅图(右)，H)各组中COL1A2的表达量，C) DRG NF1+/neo经过TTX与LTR处理后，发放频率统计(左)及光栅图(右)。
在这里，我们借助于MEA，来试图确定是否NF1+/neo型周围神经元也会有与NF1+/neo型中枢神经系统神经元一样的电活动增强表型。Fig. 5A展示的实验结果证实了这一点。NF1+/neo型背根神经节细胞相对WT对照组而言，有着3.4倍的动作电位发放频率。
除此之外，我们还发现TTX和LTR都能降低该样本的超兴奋性表型（Fig. 5C）。相比对照组而言，药物处理组的下降幅度高达85%。
上述结果都证实了，NF1突变后感觉神经元的超兴奋性是由HCN通道来调节的。
另外，NF1+/neo型背根神经节细胞COL1A2的分泌（中期因子，和肿瘤的发生发展密切相关）量，相较WT野生型及NF1+/1809型而言都要高很多（Fig. 5H）。
6.COL1A2的分泌是由神经活动决定的
Fig.7 D)RAS在在WT DRG, NF1+/neo及NF1+/1809各组中的活性，E)经过TTX或LTR处理后RAS的活性变化，(F)经过IN-1处理后，DRG的发放频率变化及(H)COL1A2含量变化。
与在中枢神经系统神经元细胞中观察到的现象一致，RAS活性在NF1+/neo型及NF1+/1809型背根神经节细胞中都会有相对WT组而言2.1倍的升高（Fig. 7D）。而TTX及LTR都能将NF1+/neo型背根神经节细胞的发放频率降低2.5-2.7倍之多（相较未处理组）。另外，使用IN-1去抑制RAS，并不会太多影响到NF1+/neo型及背根神经节细胞的电活动。但是同样的处理，会导致COL1A2的生成量发生4.5倍的下降（Fig. 7H）。
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Annals of Neurology在癫痫合并疑似脑炎的病例中发现Drebrin自身抗体 |
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