研 究 概 述

 

      转录因子TCF4与中枢神经系统发育关系密切，其单倍体基因缺失或突变可导致人类Pitt-Hopkins综合征（PTHS）。患者表现出严重的认知障碍、运动迟缓、肌张力低下、呼吸异常、典型的自闭症行为和小头畸形等症状。然而，病理性的TCF4突变是如何影响人类神经组织的，人们对此知之甚少。

      已有研究表明，现有的小鼠PTHS模型无法准确模拟患者的神经特征。因此，来自加州大学圣地亚哥分校医学院的Muotri教授团队尝试构建出人源的类器官疾病模型。他们利用干细胞技术，将携带TCF4突变的PTHS患者和其健康父亲的iPSC诱导分化为3D皮层类器官（CtOs）。后续的检测发现，该突变可导致病人组样本的Wnt 通路失调、SOX基因表达降低，进而抑制神经祖细胞的分裂增殖，生成的大脑皮层神经元更少，其放电能力也随之受损。研究小组尝试了药物处理和多种转基因方法来逆转上述表型。其中一种转基因方案不但显著提高了外源TCF4表达量，还能够在分子、细胞和电生理三个维度上修复PTHS样本的神经系统，并实现功能上的治疗作用。这些成果于2022年5月2日发表在Nature Communications（IF 17.7）上。

电生理检测及分析
 

 

 

01

实验条件

 

• 在MEA板上培养类器官protocol：

首先，在类脑器官诱导分化的第20天，按照10个/孔将它们转入MEA板（Axion BioSystems）。使用含有GlutaMAX、1% Gem21、1% NEAA、10ng/ml BDNF、10ng/ml GDNF、10ng/ml NT-3、200mM L-抗坏血酸和1mM二丁酰-cAMP的Neurobasal 培养基培养7天。之后，更换为含有1% GlutaMAX、1% Gem21、1% NEAA和0.5%青霉素/链霉素的Neurobasal培养基再维持7天。最后，将类器官保存在BrainPhys培养基(Stem Cell Technologies)中，直至上机检测。每个样本复孔N≥3，并且至少进行2次独立的实验以保证结果的准确性。

 

• 软件设置：

使用Maestro系统和AxIS软件（Axion BioSystems）进行记录，数据过滤带宽为10-2.5k Hz。神经元发放阈值设置为每个电极上噪声值标准偏差的5.5倍。MEA板置于在Maestro设备中静置3分钟后，开始记录并保存3分钟的原始数据，最后使用Neural Metric Tool（version 2.5.1）进行数据分析。

 

• 关键参数定义：

活跃电极：每分钟检测到≥5 spikes的电极。

平均放电率：孔内各活跃电极在单位时间内检测到的发放数量之均值。

网络簇放电数量：相邻发放间隔不超过100 ms，同时最少有25%的电极记录到的≥50 spikes所对应的簇放电总数。

 

 

02

PTHS来源CtOs表现出异常的放电特性

 

图S5 Maestro MEA平台检测CtOs样本电生理功能

a-左）种在MEA板内的CtOs显微镜下明场图像。

a-右）病人及其亲本来源CtOs体外诱导分化第8周平均放电率柱形图（N=4）。

b）从类器官保存在BrainPhys培养基开始，连续30天两组样本平均放电率变化图。

      研究者借助Maestro MEA平台比较了4对PTHS患者/父亲来源的CtOs样本的电生理功能差异。补充图5数据表明病人组CtOs在诱导分化第8周的平均放电率（a-右）和随后连续一个月记录到的每分钟发数量（b）都显著低于对照组，说明前者发放功能严重受损。

      他们随后设计实验，从三个方面分析了这一现象的原因：1. PTHS类脑器官中皮层神经元含量严重不足，神经元种类多样性差；2. 病人来源的神经元胞体更大，这种异常的形态可能会损害神经元轴突的伸展和建立突触连接的方式；3. RNA测序分析显示一些参与神经生成、分化和兴奋性调节的相关基因在病人来源的样本中表达量明显下调。

      这些数据共同表明，PTHS来源的神经元在形态、生理和转录组方面的异常表现导致了其兴奋性的降低，这一发现为后续开展基因或药物治疗干预提供了新的机会。

图9d 基因修饰TCF4的类器官电活动检测

d-左）转染TCF4过表达及对照载体的CtOs（4号“患者-父亲样本对”‍）在诱导分化第2-3个月MEA分析光栅图。单个电极记录到的发放随时间变化图作为一行，孔内16个电极从上至下依次排布。纵向的红色线框则代表整个神经网络的同步簇放电。

d-右）各组样本的平均放电率和每分钟网络簇放电数量随时间变化折线图。

 

      为了了解基因修饰对类器官分子病理学及功能的影响，研究者选择了在样本大小和内部结构上差异最大的4号“患者-父亲样本对”作为分析对象。随后采用3种不同的转基因方案，将正常TCF-4外显子序列转入iPSC诱导分化的神经祖细胞NPC或胚体中。其中方案2用到了一段含12个μE5调节结合位点的启动子序列，能够实现TCF-4基因的过表达（表达量比亲本对照高4倍）。

      随后RT-PCR检测发现，在转导的PTHS NPCs中，TCF4的下游直接转录靶点GADD45G（DNA损伤诱导基因G）及衰老标志基因（CDKN2A）的mRNA表达量均有显著提升，体现出TCF4转录因子功能的恢复。免疫染色的结果表明，过表达TCF4的患者样本在分化过程中不但祖细胞和皮层神经元数量大量增加，而且能够发展出丰富的神经花环(neural rosettes)，最终形成的类器官形态也与其父亲组非常相似。将它们转移至BrainPhys培养基后Maestro MEA检测发现，它们的两个关键电生理参数（平均放电率和每分钟网络簇放电数（图9d））都显著高于其转基因空白对照组，并接近父亲对照组的水平，表明其电生理功能得到恢复。（编者按：从分化第40天开始，父亲组的平均放电率逐渐降低，网络簇放电甚至降至消失。但过表达TCF4的PTHS样本这两个参数在第40天以后依旧维持一个比较高的水平。说明过长时间培养的转基因组存在超兴奋性的风险，未来需要改进基因修饰策略以及扩大样品量来优化这一结果。）

      最后，结合其他检测方法的结果，作者证明了与TCF4功能缺失相关的细胞病理学表型--包括祖细胞增殖受损、衰老发生、SOX基因的表达失调、神经元分化及功能异常--均可以经由过表达TCF4的方式在神经发育过程中得到纠正。这一研究为PTHS靶向治疗开辟了新的途径，对于那些与TCF4相关的遗传性疾病的治疗也具有借鉴意义。

 

 

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