已有研究表明，肠道共生菌群可以辅助宿主食物消化，协助肠黏膜免疫系统的发育，抑制有害微生物群的生长，从而影响机体的代谢、认知和免疫调节功能。在本文中，来自哈佛医学院的研究者们以大肠杆菌 Nissle（益生菌EcN）作为研究对象，来探究T细胞受肠道共生菌影响的机制。

      他们构建了一系列细胞壁和外膜结构相关基因缺失的EcN菌，借助Maestro新一代Impedance技术，以无损实时的方式记录到它们与野生型EcN菌都能扰动上皮细胞的屏障功能，并且前者能够在更短的时间内引起屏障完整性的下降（图1）。这一实验的详细过程如下：

图1 体外检测荚膜缺失突变体EcN菌对上皮屏障的影响

A）不同处理Caco-2的BI值随时间变化曲线图（EcN和ΔkfiCD均为1:1000稀释；-为未处理阴性对照；EGTA为阳性对照）

B)三个稀释梯度的EcN和ΔkfiCD处理Caco-2后，屏障指数下降50%所需时间比较（N=3, t test, ***P < 0.001, ****P < 10–4)）

C)三个稀释梯度浓度野生型及6种EcN突变体处理Caco-2后，屏障指数下降50%所需时间比较

 

      研究者将Caco-2细胞接种在CytoView-Z 96板培养至屏障形成后，分别加入野生型和荚膜缺失突变菌（ΔkfiCD）处理，通过观察屏障指数BI值 (两个交流电频率下（低频-1k Hz/高频-41.5k Hz）测量的细胞层电阻之比) 的变化来评估屏障完整性。图1A结果表明两种细菌都诱发了BI值的显著下降，但突变菌处理组下降明显比野生型更快。图1B显示出不同稀释倍数的突变菌处理组其纵坐标（屏障指数下降50%所需时间）均低于对应的对照组，并且这一数值与加入的菌体总量成反比。

      为了验证上述结果，研究者又选取了其他细胞壁和外膜结构相关基因缺失的EcN菌重复了上述实验。图1C结果可以看出，与野生型EcN相比，脂多糖抗原缺失突变体（LPS O-抗原Δb1,3Glucwaaw）略微延迟了BI的下降；只有两组荚膜突变体（ΔkfiCD和ΔkfiB）处理表现出显著破坏屏障功能，其余组表现与WT相差不多。这些结果表明， 荚膜的丧失实际上增强了大肠杆菌破坏IEC屏障的能力。

图1 野生型或ΔkfiCD菌刺激小鼠上皮细胞所引发的不同反应示意图。

 

      此外，研究者还将上述菌体以单克隆形式接种了无菌小鼠（GF）。 野生型EcN和其中一种荚膜缺失突变体（ΔkfiCD）刺激小鼠肠道上皮细胞（IECs）所引发的反应如图1所示。免疫分析检测结果显示，野生型EcN表面的荚膜可调节细菌与IECs的相互作用，进而启动结肠固有层内的多细胞级联反应。其中包括DC细胞的激活和RORγ+T细胞(Th17)的诱导分化，这是抑制肠道炎症和维持肠道稳态的关键步骤。

      而接种荚膜突变体（ΔkfiCD）单克隆的小鼠肠道中诱导出的RORγ+ T细胞则少的多，几乎与GF未处理组水平相当。接种其他位点突变菌的实验结果也证实了EcN对RORγ+T细胞的诱导强烈依赖于荚膜的存在。此外，他们还通过共聚焦成像观察到了由中性粒细胞和单核细胞外渗到宿主结肠腔内形成的"腔内管型（intraluminal casts）"。进一步检测发现管型中还包含大量的突变菌，这种包裹结构使它们得以逃脱宿主免疫系统的攻击，维持宿主-共生菌的动态平衡。

附：阻抗检测实验方法

• 人结肠大肠腺癌（Caco-2）细胞系由Ohad Gal Mor教授（以色列Sheba医疗中心）友情提供，培养在Dulbecco改良的Eagle (DMEM)-F-12培养基中，辅以20%热灭活胎牛血清(FBS) 和2mM L-谷氨酰胺。按照3*10^5个细胞/孔的密度将其接种于CytoView-Z 96板上，并由Maestro新一代Impedance模块（Axion BioSystems）在37℃和5% CO₂下持续监测（记录时间间隔为1min）4天，直到达到完全汇合并形成稳定的屏障。

• 将EcN及其相关突变株的单菌落接种于Lennox Luria-Bertani（LB；BD Difco）培养基，37℃培养过夜。然后使用不含抗生素的Caco-2生长培养基将上述细菌稀释至浓度1×10^9 cfu/mL。

• 将稀释后的细菌加到Caco-2细胞中共培养，并持续记录BI随时间变化曲线（数据计算时以No Treatment Control作为对照对BI进行矫正）。