研 究 概 述

      已有研究表明，在成年大脑中，小胶质细胞能够执行多种功能，包括监测神经元活动的变化，调节学习和记忆，充当损伤传感器以及在炎症条件下发挥吞噬作用。这些小胶质细胞-神经元相互作用中有许多是通过细胞间信号传导 (如嘌呤能信号通路) 的，并且需要细胞因子、神经递质和神经肽等组分的参与，而这通常需要高能量消耗和线粒体代谢。科学家们推测，那些以神经元兴奋性改变为典型特征的神经系统疾病的发病原因，可能就在于小胶质细胞不能有效监视和调节神经元网络功能。

      载脂蛋白E (APOE) 可以与胆固醇或其它脂质结合形成脂蛋白颗粒，从而介导中枢神经系统和外周组织中的脂质转运。在大脑中，APOE主要由星形胶质和小胶质细胞表达，其编码基因有3种常见的亚型：ε2、ε3和ε4。其中APOE3是人群中最常出现的形式，常被称为“野生型”；APOE4则是已知的发生晚期AD的最大遗传风险因素。对于这些富集在胶质细胞中的遗传变异是如何影响神经元网络功能的，科学家们依然没有清晰的答案。

MEA 实 验

      作者将APOE3或APOE4的 iMGL条件培养基加入到APOE3神经球培养体系中24h以后，借助Maestro MEA检测不同基因型iMGL代谢产物对神经元电生理功能的影响（图5 A&E）。图S6-C结果显示，APOE4 iMGL降低了APOE3神经球培养物的单位时间发放数量、簇放电数量和簇时长等参数。给球状体更换新鲜培养基2h后，再次检测 (图S6-D) 发现其发放能力得到了部分地恢复。

图5

图S6

      作为大脑中胆固醇的主要转运者，APOE介导了胆固醇和其他脂质在神经元和胶质细胞之间的传递。 由于在APOE4 iMGL培养物的上清液中检测到高浓度的APOE和胆固醇，因此作者提出假设是这些成分影响了神经元电活动。Maestro MEA检测结果（图5F）证实外源胆固醇确实能够显著降低APOE3神经元的加权平均放电率。膜片钳检测结果也证实了外源性胆固醇还能够使静息膜电位超极化，神经元兴奋性降低。

图5

      进一步的测序结果显示，APOE4 iMGL CM的处理也显著上调了APOE3球状体中G蛋白门控的内向整流钾通道GIRK3的mRNA和蛋白表达量。那么GIRK3的增效是否是APOE4 iMGL CM抑制APOE3神经元活动所必需的？为了回答这个问题，研究者采用CRISPR技术获得了敲低GIRK3基因的APOE3神经球。虽然Maestro MEA检测结果显示APOE4 iMGL CM处理48h后，敲低组和对照组之间的发放数量没有明显差异（非配对t检验，p值=0.1758），但前者的簇放电百分比有显著提升（图5M），表明GIRK电流可能对调节神经元簇放电特别重要。这一数据与其他实验的检测结果共同说明了由于APOE4 iMGLs的脂质再摄取不良导致胞外胆固醇的积累，后者引发GIRK电流的增效从而抑制神经元电活动。

 图5

      接下来，研究者将APOE3 iMGLs暴露在外源脂肪酸中检测到其脂质滴积累之后，对样本展开相应的基因、蛋白及形态检测。结果显示这一处理能够诱发APOE3 iMGL表现出类似于APOE4 iMGL的表型。最后，他们又试图反向操作，验证耗尽APOE4 iMGLs的脂质滴是否会削弱APOE4的表型。Triacsin C作为长链脂酰辅酶A合成酶ACSL1抑制剂，已被证明可以防止脂质积累。因此，他们将Triacsin C与APOE4 iMGLs CM一起处理APOE3球状体，Maestro MEA 检测结果（图6M）显示其簇发放百分比则显著提升，与APOE3 iMGLs CM处理组水平相当。这些结果表明，小胶质细胞中脂质平衡是维持其能够支持正常神经元网络功能所需的监视平衡状态所必需的。

图6

MEA 实验条件

1. 使用Poly-D-Lysine（Cat#P6407-10X5MG；SigmaAldrich）包被CytoView MEA 48孔板（Cat# M768-tMEA-48B；Axion BioSystems）。每个孔包含16个直径为50μm的低阻抗PEDOT电极，间距为350μm。

2. 将完整的球状体神经元种到各孔中，使用Matrigel液滴（Cat # 354277; Corning）覆盖以将其固定。在37摄氏度环境下静置15-30分钟后，加入温热的BrainPhys培养基（Cat#05790；STEMCELL Technologies）淹没细胞，并继续培养至少四周样本恢复状态后上机检测。

3. 在将条件培养基加入到球状体培养体系之前，先使用Axion Maestro Pro MEA系统（Axion Biosystems）采集一轮数据作为基线。然后吸弃一半体积培养基，加入一半体积iMGL培养基。继续培养24-48h，再进行第二次数据记录。

4. 以12.5 kHz的采样率记录自发的神经活动30分钟，发放检测的自适应阈值设置为基线噪声标准差的5.5倍。两个关键参数定义：簇放电--相邻发放间隔不超过100 ms且总发放数量不小于5个；活跃电极--每分钟检测到≥5个发放的电极。选择至少有3个活跃电极的孔进行数据分析。神经元电活动相关参数使用Neural Metric Tool（Axion BioSystems）导出，相关数据图表由Prism GraphPad绘制。

END