研 究 概 述

    

慢性疼痛所带来的临床负担正在加重,相关的人类细胞研究模型也就变得愈发重要。但目前能被用来将hPSC分化为感觉神经元的实验方案稳定性欠佳,所获得的细胞异质性太高。
 
我们开发了一种混合分化路线,能很好地解决这个问题。NEUROG2的诱导表达被预先构建在hPSC细胞系中。先施以小分子化合物将其诱变成为感觉前体细胞,再将NEUROG2这种转录因子过表达,就能稳定地获得伤害感受神经元了。
 
这样得到的神经元细胞能表达一系列关键标志物基因,并具备疼痛感受器特异的离子通道。在Maestro MEA电生理功能实验中,它们也能对辣椒素等物质造成的伤害性刺激做出反应。随后,我们还建立了疼痛样模型,以期发现那些参与了疼痛传导的基因和通路。总体而言,本研究为慢性疼痛的研究提供了一种可用的工具。
 
接下去,我们针对文中的MEA实验部分做适当展开。

 

 

 

MEA 实 验

 

 

在MEA电生理实验中,感觉神经元能够对一系列伤害性刺激做出功能性反应。
 
为了弄清楚hPSC衍生伤害感受神经元是否具有功能,能否对刺激做出反应,我们对两种细胞系分别经不同分化条件所获得的四个样本做了MEA比对实验。将开始分化后第11天的前体细胞铺种入专用的96孔MEA电极板(Axion公司),上机后就能实时观察样本间在自发及药物诱导兴奋性上的差异了。我们可以选择对不同时间点下单孔内所有电极记录到的自发放电进行比较(如图4A),通过发放的频率及规律来判断神经元的成熟度及神经网络的形成。也可以如图4B所示,统计整板所有样本在某一时间点的平均发放频率,并与其它时间点做比对,以了解样本的生理活动规律,为后续的药物暴露实验做准备。

 

Fig.4A DPP代表种板后第N天。如我们所预期的,G3_Hybrid感觉神经元并不像皮层神经元那样会产生网络发放(A图,单孔内8个电极各自在100ms内记录到的发放)。在10DPP时,整板样本的基础兴奋性相比5DPP时有明显增强,而且这种趋势在之后的10天内都能被稳定保持(B图,柱状代表全板样本的平均放电率,黑点代表单孔的平均放电率)。

 

伤害性刺激实验中用到的药物主要由TRP离子通道(在感觉神经元中广泛表达)介导发挥作用。首先测试的是对应于TRPV1通道的辣椒素。从图4C的左列可见,两种定向分化方法(标准和混合)诱导的神经元都能对药物做出显著反应。待药物洗脱后,其发放频率又能恢复到基础值。使用TRPM8和TRPA1通道的激动剂WS3和JT10后,我们也能记录到类似的变化。这就说明这些神经元群落都含有具备生理功能的感觉神经元。另外,在皮层神经元上重复这些实验并不会导致其兴奋性改变,证明了上述实验结果的特异性。

Fig.4C 黑色、红色及绿色分别对应于药物暴露前、中、后。G3和B1两种细胞系分别用标准和混合条件进行分化。编者按:最右下角图的标注有错误(应该是JT0,不是WS3)。

    

那么,在单个神经元水平的情况又是如何呢?发放波形图(如图4D)显示,大部分电极捕获到的数据很稳定,能够对应到单个神经元。少数那些波形变化较大的单电极数据也能通过软件的拆分来用于单位神经元的计算。

 

Fig.4D 每个波形图上方显示单电极平均放电率。每次发放的波形用不同颜色区分并叠加,以便您观察波形的稳定性,并以此判断发放是否来自单一神经元。


       这样,我们就能具体算出对药物暴露起反应的神经元数量,并重点关注那些相对于药物处理前而言,在接受高浓度KCl和某种TRP激动剂依次处理后,都能做出更高正响应的神经元。它们的占比在分化更好的样本中应该更多。基于上述的神经元数量和响应频率的数据,我们可以获得四个样本对应于三种激动剂的发放频率-累积概率图(图4E和S5D)。通过比较可知,混合条件分化所得的感觉神经元,在药物暴露下的兴奋性变化程度来得更大。

 

Figure.S5D&4E 上方从左至右下角依次为对应于B1_H, G3_S, B1_S及G3_H样本的发放频率-累积概率分析结果。KCl组作为对照,是其它处理条件引起样本正反应程度的参照。右下角小图显示的是不同分组样本中,每一个神经元单位的发放频率统计。

 

我们还能计算出在某个刺激条件下,每个培养体系中响应细胞的占比。从图4F中可知,无论是用辣椒素、JT10还是WS3来模拟伤害性刺激,使用了混和分化条件的两种神经元群落都具有相对标准条件下而言更多的响应神经元比例。也就是说使用该新型分化条件能获得更多的功能性细胞。虽然在混合刺激下,各组样本的该比例都有所下降,但是在进行混合分化后,不同细胞群落间的差异要来的更小。从这种生理学实验结果中能得到与之前其它类型实验相一致的结论:那就是对同一细胞株而言,新型分化条件能够使您获得更高比例的伤害感受器。

 

Fig.4F 柱状图顶部的数字为平均值。原始数据来自于三次独立分化的共267个培养的细胞群落。

 

 

讨论

 

Axion的MEA系统赋予我们对各种培养物开展大规模功能性验证的能力。在三种不同的方法学(流式、10X Genomics单细胞RNA测序及MEA电生理)实验分析中,我们都发现了混合分化条件下两种细胞系均能产生更多的感受神经元,但是单细胞RNA测序和MEA数据之间的差距明显较大。可能是我们采用的在深度和宽度之间较为平衡的测序策略,限制了10X Genomics单细胞RNA测序实验的灵敏度,从而导致其结果中遗失了很多低丰度mRNA的信息。而出于对激活剂特异性的信心,我们认为从MEA平台上获得的分析结果会来得更为可靠。

 

 

 

 

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END

 

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