概述

 

 

 

探究人类大脑的发育机制以及揭示神经发育和精神疾病的致病机理一直是神经生物学的重要内容。由于人类和非人灵长类动物的脑组织极难获取且涉及到伦理问题，目前有关人类大脑皮层发育的认识和理解主要源于对啮齿类动物脑的研究。近年来，诱导多能干细胞(iPSCs)技术的建立和三维培养方法的快速发展使得类脑器官(organoid)应运而生。类脑器官是在体外培养的具有与人脑类似结构的三维神经组织。大量的研究已经证实，类脑器官能够很好地模拟神经发生、神经元迁移、皮层分层及神经环路建立等体内过程。

 

类脑器官目前面临的主要挑战是其并不能完全呈现大脑的精细结构，例如下丘脑的不同核团。近年来，美国宾夕法尼亚大学Guo-Li Ming教授的团队在Cell Stem Cell (if 24.6)上发表了文章Generation of hypothalamic arcuate organoids from human induced pluripotent stem cells。他们建立了一种将iPSCs诱导分化成下丘脑弓状核类器官的方法。得到的下丘脑弓状核类器官呈现出与人源ARC相似的细胞多样性和分子特征，并可用于Prader-Willi综合征模型的研究。

 

图2 72天龄的C3、Min-1及Maj-1组下丘脑弓状核类脑器官电活动比较

(Q)C3、Min-1及Maj-1组类脑器官在微电极阵列上的形态

(R)上述各组在120s内的自发放电光栅图 (S)上述各组在120s内的自发平均放电率统计图

1.先前的研究发现：ARC脑区神经发育进程中伴随shh信号被激活、Wnt被抑制的现象。据此，Guo-Li Ming团队建立了iPSCs诱导分化生成ARCO的策略。得到ARCO后，研究者在分子水平(免疫组化及单细胞测序等)确认了ARCO具有与人源ARC相类似的特征及发育标记物，如转录因子OTP、DLX、TBX3及POMC等。这些结果表明在ARCO中产生了多元化的神经元群体。

2.为了从宏观水平研究ARCOs类脑器官细胞群体多样性及分子标记物，研究者对不同的发育节点的C3及C65组ARCOs进行了单细胞转录组分析，并与Allen Brain Adult Human数据库中的人脑ARC不同亚核进行对比分析后，发现ARCOs具有有人源ARC相似的神经元群体多样性及分子标记物。

3.从神经发育角度，研究者对新生儿的ARC核团进行了RNA测序，并与ARCOs进行了比对，发现两组样本的细胞类型分布具有显著的重叠。

4.在上述ARCO研究的基础上，研究者利用两种不同异位断点导致PWS的患者体细胞生成了2种iPSC并诱导分化成ARCO：Maj-1型，缺失外显子2~3；Min-1型，缺失外显子17~18。从形态学上观察，PWS组的ARCOs尺寸更大。ARC具备正常功能的一个重要标志是能响应瘦素(Leptin)激活POMC+神经元，并释放促黑素细胞激素(MSH)。作者使用瘦素处理PWS模型及对照组的ARCO后，发现对照组ARCO的JAK2和STAT3磷酸化水平提高，但在PWS ARCO中是降低的。此外，对使用瘦素处理过的ARCO培养基进行ELISA分析显示，对照组ARCO中的的MSH水平增加，但PWS ARCO的MSH水平较低。这揭示了PWS的ARCO模型存在明显的神经增殖和分化缺陷；电生理功能分析(MEA)上看，PWS组ARCOs的神经元自发放电的频率显著低于对照组C3。以上这些结果表明，PWS ARCOs存在功能缺陷，并有作为PWS疾病模型的可能性。

• 预先使用基质胶(Matrigel)包被12孔MEA电极板；
• 将生长至60天的ARCOs种植在12孔MEA电极板上，并使用BrainPhys neuronal 培养基继续培养；
• 培养2周后，开始记录ARCOs神经自发放电。
• 记录方法为控制ARCO环境温度至37℃，连续记录120s，记录软件为Axion BioSystems的Maestro AxIS solfware；
• 计算平均放电频率时仅将活跃电极纳入统计；
• 使用Neural Metric Tool软件对ARCOs自发放电和簇放电进行分析及作图；

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