研 究 概 述

    

 

      肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 是一种神经退行性疾病,其特征是患者大脑和脊髓中的运动神经元 (MN) 逐渐丧失功能,导致肌肉萎缩和瘫痪。鉴于ALS患者生存期短,通常在发病后两到四年内去世,科学家们从未停止过对ALS致病机制及治疗方法的探索。已有的研究结果表明,RNA 结合蛋白 TDP-43 在细胞质中的错位分布和异常聚集是ALS的病理标志。但是到目前为止,研究者对于TDP-43突变的致病机制仍然知之甚少。

 

       在本文中,来自加拿大麦吉尔大学的Thomas M.Durcan团队挑选了ALS病人中第一和第三最常见突变体(分别为TDP-43A382TTDP-43G348C),借助CRISPR/Cas9技术首次得到了两个纯合敲入iPSC细胞系。经检测,它们分化成的MN在细胞活力以及TDP-43在细胞中的定位、磷酸化程度、溶解度或聚集方面都与等基因对照组没有显著变化。随后Durcan团队用Axion Maestro MEA平台对各组神经培养物的功能进行分析,却发现两组样本的自发神经电活动显著低于对照组。后续免疫染色检测到了突触相关蛋白表达量存在异常,结合MEA检测结果共同反映出两个纯合敲入组均存在突触损伤的现象。

     

      综合上述研究数据,Durcan团队推断出ALS病人携带的突变位点导致的突触损伤和MN功能障碍,是先于TDP-43病理变化和神经退行性症状发生的。随着突触成为ALS一个有希望的治疗靶点,体外神经活动的检测指标有望作为疾病相关的药物筛选的重要参考。

 

      接下去,我们针对文中的MEA实验部分做适当展开。

 

 

 

MEA 实 验

 

 

 

我们将上述3组MNs接种在MEA板以后,利用Axion Maestro MEA平台统连续8周对样本的电活动开展监测。
 

图5.TDP-43 MNs神经自发活动的长时间变化

(A)各组MNs在24孔MEA板上分化至第6周的明场图像。比例尺单位为250 μm。

(B)各组MNs种板后连续8周的平均放电率变化,n=11。

(C)MNs培养物分化至第6周的记录长度为300秒的神经活动光栅图。

(D)TTX 处理对分化6周的MN平均放电率的影响。n=7。所有数据均显示为SEM±平均值。*p<0.05,**p<0.01, ***p<0.001,****p<0.0001。

 

       图5B结果显示,对照组样本电活动随培养时间增加而增加,在检测终结的第八周达到最大。而TDP-43A382T组在第6周时平均放电率MFR(即Mean Firing Rate, 平均放电率,由神经元放电总数除以记录时间得到)达到最大,TDP-43G348C MNs电活动在第4周达到最大并逐渐趋于平稳。并且这两突变组MFR始终小于同期培养的对照组。尽管三组细胞在电极周围分布情况非常相似(图5A),但5C光栅图和视频2结果表明两个敲入组的活跃电极数均小于对照组,反映出前者在电生理层面活跃度较低。最后使用钠通道阻滞剂河豚毒素(TTX)处理各组后,各组神经元电活动都消失了,从而证实了记录到的信号是由动作电位而不是噪音引起的(图5D)。

 

(编者按:当下,类器官已经成为神经发育、疾病建模研究及药物筛选的重要工具。本文作者也有计划建立三维的ALS类器官培养模型,以实现长期的观察及评估。Axion公司提供针对干细胞和类器官培养检测、电生理功能检测的Imaging及MEA产品,欢迎各位老师同学关注了解。本文已先行发表于生物预印本bioRxiv上,让我们一起期待作者投稿成功!)

 

视频2 MNs各组动态放电热图

 

 

 

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