研 究 概 述

      肌萎缩侧索硬化症 （ALS） 是一种神经退行性疾病，其特征是患者大脑和脊髓中的运动神经元 （MN） 逐渐丧失功能，导致肌肉萎缩和瘫痪。鉴于ALS患者生存期短，通常在发病后两到四年内去世，科学家们从未停止过对ALS致病机制及治疗方法的探索。已有的研究结果表明，RNA 结合蛋白 TDP-43 在细胞质中的错位分布和异常聚集是ALS的病理标志。但是到目前为止，研究者对于TDP-43突变的致病机制仍然知之甚少。

       在本文中，来自加拿大麦吉尔大学的Thomas M.Durcan团队挑选了ALS病人中第一和第三最常见突变体（分别为TDP-43^A382T和TDP-43^G348C），借助CRISPR/Cas9技术首次得到了两个纯合敲入iPSC细胞系。经检测，它们分化成的MN在细胞活力以及TDP-43在细胞中的定位、磷酸化程度、溶解度或聚集方面都与等基因对照组没有显著变化。随后Durcan团队用Axion Maestro MEA平台对各组神经培养物的功能进行分析，却发现两组样本的自发神经电活动显著低于对照组。后续免疫染色检测到了突触相关蛋白表达量存在异常，结合MEA检测结果共同反映出两个纯合敲入组均存在突触损伤的现象。

      综合上述研究数据，Durcan团队推断出ALS病人携带的突变位点导致的突触损伤和MN功能障碍，是先于TDP-43病理变化和神经退行性症状发生的。随着突触成为ALS一个有希望的治疗靶点，体外神经活动的检测指标有望作为疾病相关的药物筛选的重要参考。

      接下去，我们针对文中的MEA实验部分做适当展开。

MEA 实 验

 

图5.TDP-43 MNs神经自发活动的长时间变化

（A）各组MNs在24孔MEA板上分化至第6周的明场图像。比例尺单位为250 μm。

（B）各组MNs种板后连续8周的平均放电率变化，n=11。

（C）MNs培养物分化至第6周的记录长度为300秒的神经活动光栅图。

（D）TTX 处理对分化6周的MN平均放电率的影响。n=7。所有数据均显示为SEM±平均值。*p<0.05，**p<0.01， ***p<0.001，****p<0.0001。

       图5B结果显示，对照组样本电活动随培养时间增加而增加，在检测终结的第八周达到最大。而TDP-43^A382T组在第6周时平均放电率MFR（即Mean Firing Rate, 平均放电率，由神经元放电总数除以记录时间得到）达到最大，TDP-43^G348C MNs电活动在第4周达到最大并逐渐趋于平稳。并且这两突变组MFR始终小于同期培养的对照组。尽管三组细胞在电极周围分布情况非常相似（图5A），但5C光栅图和视频2结果表明两个敲入组的活跃电极数均小于对照组，反映出前者在电生理层面活跃度较低。最后使用钠通道阻滞剂河豚毒素（TTX）处理各组后，各组神经元电活动都消失了，从而证实了记录到的信号是由动作电位而不是噪音引起的（图5D）。

(编者按：当下，类器官已经成为神经发育、疾病建模研究及药物筛选的重要工具。本文作者也有计划建立三维的ALS类器官培养模型，以实现长期的观察及评估。Axion公司提供针对干细胞和类器官培养检测、电生理功能检测的Imaging及MEA产品，欢迎各位老师同学关注了解。本文已先行发表于生物预印本bioRxiv上，让我们一起期待作者投稿成功！）

视频2 MNs各组动态放电热图

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