研 究 概 述
CDKN2A基因编码衰老激活蛋白p16INK4a和p14ARF,在衰老细胞中持续上调,被认为是衰老最特异的遗传标记之一。近年来的研究证据表明,除增殖细胞外,包括神经元在内的终末分化细胞也具有类似衰老的特征。
在本文中,来自美国索尔克生物研究所的Fred H. Gage团队发现阿尔兹海默症(AD)病人脑尸检样本及诱导神经元 (AD iNs)中p16INK4a(下文简称p16)的表达量明显高于对照组。他们还发现AD iNs中几个主要代谢通路相关基因组表达量发生变化引发了代谢功能障碍。在检测到ECM 组织、DNA 损伤修复途径和促炎性衰老相关分泌表型(SASP)相关的基因均上调之后,作者设计实验证实了AD iNs能够将SASP 因子释放到胞外,触发 AD 中的促炎级联并引起星形胶质细胞增生(AD的决定性病理特征之一)。
接下来作者验证了两种常用体外诱导衰老方式(过表达原癌基因KRas和p16)均可引发健康老人来源iNs的衰老激活。Maestro MEA分析结果显示,过表达p16的样本自发放电功能明显低于对照组,说明神经元衰老的后果之一是电生理功能受损。最后,离体和活体检测结果共同证实了靶向清除AD大脑中的衰老细胞可能是减缓 AD 神经炎症和随后神经退行性变的一种新方法。该研究成果发表于2022年12月《Cell Stem Cell》(IF 25)上。
MEA 实 验
研究者首先分离了健康老人来源的成纤维细胞培养物,并通过过表达两种先驱转录因子Ngn2/Ascl1来诱导它们的转化。继续培养21天后观察到大多数细胞发育出成熟的神经元形态。随后使用流式技术分选出神经元表面标志物PSA-NCAM阳性的iNs。
图7 衰老神经元电活动检测
A) MEA实验流程示意图。首先将携带有p16或对照报告基因的慢病毒处理分选的健康人来源 iNs,随后接种至多电极阵列(MEA)板上持续培养并监测一个月(左)。标记了红色荧光蛋白dsRed 的 iNs 在种板后1小时和一个月后图像(右)。
(B) 两组样本连续一个月平均放电率MFR变化曲线。种板约2周后,Control组MFR变化斜率明显高于p16组(n=18; 双尾t检验)。
(C) 30天累积MFR比较柱形图。(先将每天组内各孔的MFR结果取均值, 再计算各组30天累积MFR平均值。**p<0.01)
(D)1uM河豚毒素TTX处理前后对照组iNs MFR比较柱形图(n=18, 配对t检验, *p<0.05)。
(E)电刺激后两组样本MFR比较柱形图(n=18,配对t检验)。
接下来,他们将携带有p16或对照报告基因的慢病毒加入上述阳性iNs中孵育,以诱导p16过表达促使iNs进入衰老状态(图 7A)。然后将转染的iNs接种于聚鸟氨酸/层粘连蛋白(polyornithine / laminin)包被的MEA 板上,并加入星形胶质细胞共培养。种板后第1天及第30天样本在显微镜下形态如图7A-右所示。(编者按:用户可直接在MEA板内对样本进行荧光标记及成像,方便快捷。)
研究者使用Maestro MEA平台记录到的两组iNs连续30天自发放电频率MFR变化曲线如图7B。从图中可以观察到在种板后前14天它们之间MFR并没有很大差异;但随着时间的增加,衰老组的自发发放水平显著低于对照(图7B&C)。作者推测对照组在前14天重构了树突网络,因此能够在随后的时间里呈现出现强劲增长的、并可被河豚毒素(TTX)特异消除的电活动(图7D)。最后对两组样本进行电刺激检测发现它们的MFR并没有明显差异(图7E)。这表明过表达p16虽抑制了衰老神经元的自发放电,但其自身仍保有发放潜能,并可经由电刺激被释放出来。这些结果共同证实了神经元衰老的后果之一是自发发放受损,这可能表现为大脑信息处理的中断。
后续检测结果显示,通过混合使用抗衰药物达沙替尼和槲皮素 (D&Q)的方式能够将培养物中表达p16的细胞数量减少到与对照组相当的水平。在体实验也证实了消除衰老细胞可改善AD小鼠晚期的认知功能。综合上述结果,反映出清除AD大脑中的衰老细胞可能是预防或治疗AD的一种新策略。
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