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研 究 概 述

 

     

      随着干细胞衍生心脏类器官培养条件的不断优化与成熟，科学家们迫切需要对得到的样本进行功能分析。在本文中，来自美国斯坦福医学院的Joseph C. Wu团队介绍了使用微电极阵列（Maestro MEA）和膜片钳电技术来检测心脏类器官电活动的详细步骤。他们通过测量细胞外场电位 (FP) 和细胞内动作电位 (AP) ，从组织和单细胞水平分别评估了心脏类器官电生理功能。

 

    文章提供了一套在 MEA 平板上接种、培养和检测三维心脏类器官电活动的可靠方法。Maestro MEA检测技术的非侵入特性允许用户连续数周甚至数月对样本进行追踪记录，为了解三维心脏类器官的动态电特性提供了一个无与伦比的窗口。FP关键参数的异常，如搏动周期（BP）和场电位持续时间（FPD）的延长/缩短、搏动间变异性的增加/减小或搏动终止等，都表明发生心律失常、严重功能障碍或毒性的风险较高。在此基础上，用户不仅可以鉴定样本自发电活动，还可将其作为一个有效的平台用于探索遗传变异、药物处理或任何其他因素对样本电生理功能的影响。

 

 

 

 

 

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MEA验条件及数据分析步骤

 

编者按：以下只对MEA实验部分进行整理，请阅读原文以获得膜片钳实验详细步骤。

 

 

准备心脏类器官培养所需试剂 （1day）

 

1. 1. 制备人类多能干细胞 (hPSC) 衍生心脏类器官培养基：

2. 将含有B27 supplement 的RPMI 1640 与 EGM2 培养基（即EBM-2 Basal Medium,来自EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 Bullet Kit）按照9:1比例混合。

3.  

4. 2. 制备 Matrigel 或Fibronectin溶液:

   a. Matrigel

i. 将Matrigel 原液（8-11mg/mL）在4℃解冻12-18h后，按照1ml/tube进行分装。

ii. 按照1:50 比例，使用 RPMI培养基稀释 Matrigel溶液，4℃保存。

iii. 剩余Matrigel原液-20℃ 保存。

 

b. Fibronectin：

i. 使用PBS稀释Fibronectin至50mg/mL，4℃保存.

注：始终将Matrigel和Fibronectin保持在冰上，以避免聚合。

 

1. 3. 按照5μL/well在48孔MEA 板孔加入稀释的Matrigel或Fibronectin。

注：需根据MEA板的类型调整包被溶液的体积。

注：只将包被液加到电极区域即可。在孔与孔之间的凹槽里加入无菌水或 PBS（48孔板为10-15mL），以防止包被液变干。

 

1. 4. 将200μL吸头尖端一英寸长度剪掉形成较大的孔径，以便在移取类器官时不会造成损伤。

2.  

 

在48 孔 MEA 平板内培养3D心脏类器官（1-2days）

 

1. 5. 将类器官转移到MEA板孔内

2.  

a. 包被孵育结束后，吸弃各孔内残留的包被液。

 

b. 使用第4步的移液枪头小心地将一个类器官连同100μL维持培养基移入48孔MEA板的一个孔中央区域。

 

注：我们制备的样本大小约为0.5-1mm，因此在MEA板的每个孔中只放置一个类器官。对于较小的样本，每孔可放置两个，但必须注意防止类器官粘附在一起。

 

注：心脏类器官的大小对电生理记录的成功与否和数据质量有着至关重要的影响。我们通过优化实验条件，发现混合约10万个细胞可制备出1mm大小一致的类器官。

 

非常小（<200μm）的类器官可能无法完全覆盖 MEA 电极，导致信号较弱。较大的类器官则更容易覆盖所有电极，增加检测到电信号以及FP振幅的概率。然而，过大（>5mm）的类器官会很难放入48孔MEA板中，我们建议使用6孔或12孔板来对较大的类器官进行检测。另外，一致的类器官大小对于测量结果的可重复性至关重要。尺寸的不同会导致发育阶段、细胞密度和结构组织的差异，从而影响电生理特性。大小一致可确保样本间有相似的微环境，减少数据的波动。

 

想要采集到高质量的电生理信号，使用高质量的类器官样本就非常重要。我们对这些样本的选择标准基于它们的形态完整性（通常健康的器官组织呈球形）和生理活动（如收缩）。我们使用的是具有清晰的球形形态并表现出持续自发跳动的类器官。需要注意的是，患者来源的样本可能会表现出不规则的跳动或收缩特性，甚至形态异常。在这种情况下，我们建议使用源自健康人的类器官作为对照来进行对比分析。

 

图2 体式显微镜下MEA孔内类器官明场图片

 

转移类器官耗时较长，期间应避免MEA板孔干掉。将样本移入孔中后，通过显微镜下观察将其置于电极上方（图 2）。接下来，可利用类器官的亲水特性使用玻璃巴斯德吸管来移动样本。

 

c. 小心地将MEA板移入培养箱。

注: 将类器官放入培养箱时要尽量减少MEA板的震动以免使其脱离电极。

注：在培养箱中放置至少4小时，期间切勿移动或触摸MEA板。

 

d. 4-5h后，每孔加入200μL维持培养基（RPMI 1640 + B27 Supplemental: EGM2，比例为9:1），然后将平板放回培养箱。

注：在添加培养基的过程中，尽量减少对样本的干扰至关重要。通常它们需要24h左右才能牢固附着。

注：过夜培养后可记录电活动。不过，在开始记录之前，建议牢固附着至少24h。

 

 

使用Axion Biosystem 的MEA系统记录样本FP（0.5h）

 

1. 6. FP记录

 

图7 Axion Maestro Pro System

 

a. 等待Maestro MEA系统（图 7）开机并且与软件连接。

 

b. 将MEA板转移到系统内静置10min。

 

c. 记录细胞外 FP 10 分钟。

注：我们不建议在 MEA 实验中使用不跳动的样本作为对照。MEA实验主要关注心脏类器官的功能，只有具有电活性的样本才会产生强健的特征信号，这是MEA检测的重点。数据采集完成后，可将MEA板移回培养箱继续长期培养，或将其暴露于任何待测药物中以检测样本对药物的急性或慢性反应。

 

分析

 

图12 类器官与电极贴合度差异对FP影响

A-C)展示从左至右样本与电极贴合良好、贴附不良、没有接触导致的FP信号差异 

 

注：想要获得信噪比高且质量好的MEA数据，确保类器官贴附在电极上至关重要。（编者按：我们推荐使用Axion为这一步量身定制的'Connected Lab'方案。）图12展示了三个代表性波形图。其中图12A样本与电极附着良好，提供了稳定和高质量的场点位信号。图12B的类器官与记录电极贴附不良/部分贴附，导致信号断断续续或信号振幅较低。图12C的类器官与电极之间没有接触，因此没有检测到电活动。

 

图13 MEA数据分析流程

A)  FP分析数据流程图

B) Cardiac Analysis Tool (CAT)软件显示的单个孔内所有电极波形图，黄色高亮的电极为Golden Channel

C）Golden Channel电极检测到代表性波形图

D）Beat Peroids随时间变化图，最稳定的一段搏动以绿色显示

E）图D中最稳定时间段内Golden Channel记录到的FP波形

 

i. 使用 Axis Navigator软件加载Configration->Cardiac offline->Field Potential算法生成.CSV文件，然后使用Cardiac Analysis Tools (CAT, 图 13 B-E）进行数据分析。

注：除了Axion CAT工具以外，还可通过自行写代码（比如在MATLAB中创建算法）完成。

注：Axion 提供了相应函数可将AxIS 原始文件导入到Matlab中。这些函数下载地址：https://github.com/axionbio/AxionFileLoader。（编者按：您可在公众号后台留言，联系工作人员索取相关资料。）

 

ii：使用CAT打开.raw和.csv文件。

 

iii: 选择并确认每个孔中Golden Channel（图13B）。

 

iv: 如图13B所示，找到复极化峰值或T波峰值, 并点击软件对话框中的 “Confirm ”图标。

 

注：每个显示电信号的孔都应仔细重复上述验证步骤。信号差或无信号的孔应排除在分析之外。

此外，软件的内置标记功能可用于根据观察到的FP波形对数据进行分类，包括 “flat”、“quiescent”和 “arrhythmic”等。图13D和13E 分别显示了具有代表性的随时间变化的稳定跳动和稳定的细胞外FP波形图。

 

图14 CAT软件导出的各参数柱形图及心率散点图

 

v. 使用 “CAT ”生成带有各种参数的 Excel 文件，以量化样本电活动（图 14A-14E）。

 

vi. 使用Axion的Metric Plotting Tool或其他如Sigma Plot、GraphPad Prism等分析软件进行统计分析。

 

 

Trouble Shooting

 

问题1：孔中培养基体积不足导致样本干掉。

应对1：确保96孔板每孔至少有50μL培养基，48孔MEA板每孔至少有100 μL培养基，以便在放入类器官后保持适当的水合作用。

 

问题2：类器官可能无法附着在MEA板底，影响数据质量。

应对2：延长培养孵育期将促进样本贴壁。评估并优化包被基质浓度，以增强附着力。

 

问题3：类器官可能会远离 MEA 孔中央电极。

应对3：类器官种板后，使用显微镜观察确认其覆盖电极区域。必要时使用10μL移液管吸头或玻璃巴斯德移液管移动样本，但确保不要损坏电极/样本。

 

问题4：在更换培养基时，类器官脱落可能导致样品丢失。

应对4：尽可能温和地进行换液步骤，减少脱落发生的概率。培养基可以沿着孔边缘缓慢添加，而不是直接添加到样本上。

 

 

 

 

 

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