图1 RDV脂肪酰化偶联物合成步骤及结构示意图

作者选择了Axion BioSytems公司的Maestro Z细胞生理分析系统，开展了中高通量的药效评价。基于阻抗原始数据（文中略去），该实验室完成了CC50、IC50、SI等关键参数的计算、统计及分析。为了有助于大家了解Maestro Z这种无标记且实时的实验特性，小编借用下面这幅Christopher F. Basler团队发表在Cell Rep.上的数据照片（同样为Maestro Z实验），作为类比。

图2 左侧为受测样本（Vero E6）阻抗动态变化的实时记录结果。基于图中原始数据的计算，即可得到右侧的梯度浓度下药物抑制病毒侵染样本能力的作用曲线, 并进而计算出IC50值。对照组及药物浓度梯度较多，Maestro Z的中高通量能够支持足够多的重复，确保实验结果的准确性。

作者通过阻抗实验得以连续观察SARS-CoV-2病毒感染Vero E6的全过程，发现在感染24h后会出现明显的CPE效应，24-48h内CPE会进一步加剧。使用RDV或其衍生物的溶液孵育Vero E6细胞1h后，以0.01的MOI感染SARS-CoV-2(编者按，MOI即感染复数，指在一个系统中感染病毒的细胞数和总细胞数之比)。同时记录感染48h后对照组与药物治疗组的阻抗值，以此计算抑制百分比。基于抑制百分比和相对应的药物浓度，计算出各个化合物的IC50。

借助96通量阻抗平台及其强大的分析软件，作者得以方便快捷地进行多个化合的抗病毒作用评价及结果展示(如Table 2)。我们可以看到，RDV脂肪酰基偶联物中4a，4b等展现出与RDV相类似的抗SARS-CoV-2作用。在Vero E6及CaIu3细胞中，基于阻抗数据计算的IC50范围分别为2.0-4.6 mM及0.18-3.6 mM，与RDV接近。

Table 2 RDV及其衍生物抗SARS-CoV-2药效结果汇总

为了验证RDV及其衍生物抗埃博拉病毒活性的作用，作者同样选择了96通量的阻抗平台，在体外水平评价了其抗trVLP(埃博拉病毒颗粒复制和转录模拟系统)与EBOV(野生型埃博拉)的作用。阻抗研究结果显示，RDV脂肪酰化偶联物4b，4e及3b表现出比RDV更低的IC50。这说明，对RDV的结构改造能够提高其抗埃博拉病毒的作用(Table 3)。

Table 3 RDV及其衍生物抗Ebola药效结果汇总

药物在血浆中的动力学过程非常重要。借助高分辨率液相质谱技术(LC-QTOF-MS)，作者监测了24h内血浆中RDV及其偶联物的含量变化。结果表明，RDV在1h时降解了约13%，在2h时降解了约43%；而其偶联物4c在相对应的时间点未观察到明显降解，在4h时约降解22.1%。这一结果有力地表明脂肪酰化能够显著提高RDV在血浆中的稳定性。RDV及其脂肪酰化偶联物的三磷酸盐(triphosphate)含量在24h内呈现逐步上升趋势。这一现象提示RDV及其偶联物在血浆中的代谢过程可能与磷酸化有关。

在抗病毒作用分子机制层面，作者使用qPCR技术测定了DMSO对照组和RDV及其偶联物治疗组的病毒RNA表达水平。与阻抗实验的结果一致：无论RDV还是其脂肪酰化偶联物3a和4a均能够抑制新冠病毒和埃博拉病毒的RNA合成。

1.使用纤连蛋白fibronectin包被96 孔CytoView-Z阻抗板；

2.将Vero E6细胞以7.5x10000/每孔的密度种板；

3.将96孔板放入Maestro Z设备中，设定环境为37°C 和 5% CO2，并记录24h以稳定细胞状态；

4.使用2% FBS的DMEM按照6：1的比例稀释药物。除去旧培养基后，使用药物稀释液孵育细胞1h；

5.然后使用SARS-CoV-2以0.01的MOI感染细胞；

6.感染后连续记录48h内的阻抗变化；

7.所有96孔板均设置空白组及对照组；

8.为了计算抑制百分比，首先将感染后1h的阻抗值作为标准，对48h内的数据进行归一化处理。随后使用以下公式计算抑制百分比：%inhibition = 100*(1-(1-average of treated Cells) / (1-average of infected control))。

针对SARS-CoV-2，大多数RDV脂肪酰基偶联物具有与母体药物相类似的IC50，这说明RDV在结构改造后仍然具有类似的抗病毒活性。而血浆代谢研究表明RDV脂肪酰基偶联物具有更好的稳定性。这些成果启发了科研工作者去寻找更多具有长效抗病毒作用的药物。体外实验的突破性进展，也为下一步开展在体实验提供了充分的前瞻依据。

编者按，上述结果表明，借助Maestro Z中高通量细胞生理表型分析平台，我们能够可靠高效地对众多潜在化合物进行药效评估。这将大大缩短我们找到解药的时间，拯救无数的生命！

末了，向所有工作在一线的抗疫人员致敬！希望新冠早日被彻底消灭！