研究成果
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利用QMI(定量多重免疫共沉淀)技术,我们发现CDD神经元下游的突触蛋白有大范围的变化,它们可能影响到了神经网络的形成。
为了了解这种异常的谷氨酸能信号对于发育中神经网络的影响,我们先从单细胞水平出发,对iPSC衍生2D单层皮层神经元样本(10周龄)开展了全细胞膜片钳记录实验。结果找到了样本的超活跃电表型之内在原因:电压门钠和钾离子通道的超兴奋及功能丧失。
图4 h)使用平面微电极阵列 (MEA) 的皮质类器官电生理记录示意图
i)分化16周后,CDD组和对照组皮层类器官神经网络活动的光栅图展现,及表征神经功能的平均放电率 (j) 和同步指数 (k) 随时间的变化
为了能进一步在介观水平评估皮层类脑的功能,我们使用了Axion公司的MEA系统,连续每周记录胞外自发电活动。实验中使用了12孔MEA板,每孔含有64个直径为30μm,间距为200μm微电极(参见图4h)。在提前使用poly-L-ornithine/laminin对孔底进行包被处理后,我们将大约4个6周龄的皮层类脑器官放入每个孔中。在每周两次更换培养基后的第24小时采集样本信号。首次记录为种板后2周,即样本分化后第8周。按照上述流程,我们对3个不同的CDD细胞系独立开展了3次重复实验。
S4 附图中CDD组与对照组皮层类器官在3min内的自发放电总数(左)、簇放电总数(中)及网络簇放电总数(右)随时间的变化
在上述近6个月的MEA实验中,这些皮层类脑器官的电活动都有所增加。从单通道发放频率、簇放电频率及发放同步性等参数的变化来看,这种趋势在不同的样本间相当一致。除此之外,我们还在CDD神经网络发育早期观察到了发放频率的大幅增加现象及过于同步之网络的存在(图4i-k及S4f)。这些数据突显了人CDKL5基因在神经网络超兴奋及过同步性方面所造成的影响。
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