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在伤害性刺激下,感觉神经元的电压门控钠离子通道(特别是Nav1.7和Nav1.8这两种)会诱发动作电位,从而将周边神经系统获得的信息传递到中枢神经系统。这些通道对于炎性痛的发生至关重要。我们通过细胞实验来筛选能够调节电压门控钠离子通道的化合物,就是在假定这些体内的关键离子通道在体外的细胞中也存在的前提下开展的。
之前这方面研究的体外电生理实验都会用到急性切片组织。然而,要长期维持这种样本的存活很困难。微电极阵列作为一种潜在的替代技术,可以长期记录神经发放活动,所以很适合被用来对慢性疼痛的持续致敏作用开展评估。
在本研究中,我们将NGF和IL-6这两种和慢性炎性痛相关的炎症递质加入到(体外培养的)成年小鼠原代DRG神经元中,通过MEA实验发现样本的放电频率会随之提高。这些样本中能够检测到Nav1.7和Nav1.8蛋白。而将其阻断后,NGF和IL-6处理所导致的热激发放电就会受到巨大的影响。以上结果说明这两种离子通道的作用导致了DRG的受激放电。这项工作着重于MEA在感觉神经元药理学方面的应用,将有助于镇痛化合物的发现及其作用机制的分析。
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图1 NGF和IL-6处理会导致小鼠原代DRG样本急性并可持续地提高兴奋性及热介导受激发反应。
从左至右纵轴依次为:活跃电极占比、每孔发放数量Log值 、对热处理有反应的电极占比。实验使用了48孔的Axion MEA板,每孔电极数量为16个,结合Maestro MEA系统进行电信号记录和分析。模拟热刺激时,将温度设为42℃并持续5分钟。MEA测试时间点为加入NGF和IL-6后的第3、第48和第72小时。
这些实验数据表明了,NGF和IL-6能够显著地动员静息态神经元进入兴奋态,并提高样本整体的发放数量。另外,在体外实验中,它们可能介导了急性和持续的温度超敏感性。
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图2 Nav1.7和Nav1.8的选择性强力拮抗剂能够抑制敏化后的DRG样本自发电活动
A图为具代表性的活动电极在加药前(左侧列)和加药后(右侧列)记录到的样本光栅图对比。所加药物为各种钠离子通道亚型的抑制剂。在这之前,样本已经用NGF和IL-6敏化处理了72小时。数据计算后(见图C),我们发现即使在纳摩尔的浓度下,Nav1.7、Nav1.8的抑制剂都能明显降低DRG样本的自发电活动。而中枢神经特异性的Nav1.1/1.3拮抗剂却几乎无效。
B图中的实验,改用分化21天的原代小鼠胚胎皮层神经元,以进一步确认在DRG样本中观察到的痛觉特异性离子通道的亚型选择性调控现象。该实验结果符合我们的预期:ICA-121-431对皮层神经元的自发电活动有着强烈的抑制效果;相比之下,针对Nav1.7/Nav1.8的两种拮抗剂产生的效果要弱很多。
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图3 Nav1.7和Nav1.8的强效选择性拮抗剂能够抑制敏化DRG样本的热激发反应。在加药处理前,样本被MEA检测到的热反应通道占比为35%左右。两种拮抗剂分别将这个数据降低到了20%和4%。
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共聚焦成像结果显示,NGF和IL-6处理组相比对照组而言,Nav1.7/1.8阳性神经元的比例并没有增加(图A/B)。另外,qRT-PCR检测(图C)也显示,上述两组细胞在钠离子通道亚型的表达上也无明显差异。
之前通过使用临床前动物模型,人们在体内水平展现了Nav1.7和Nav1.8在炎性疼痛以及热痛敏反应中的作用。只需数秒钟,有害温度就开始发挥作用。与此发现相一致的是,在有害温度下(42℃),这种疼痛感受器所具备的功能性温度敏感机制被证明能够在体外维持并重现。更重要的是,我们观察到了这种热介导的受激反应能够被Nav1.7/1.8的拮抗剂所抑制,这与药物在体内热痛敏中的作用一致。
与早期的几篇报道相反,我们发现NGF和IL-6对于Nav1.7/1.8的表达没有影响。而且(在体外细胞模型MEA实验中)发现敏化处理3小时后,自发电活动的急性调控就已经发生了。所以我们倾向于使用一种直接激活模型,即离子通道的异构体被直接活化并导致急性痛觉敏感效应,(来解释这些表型现象。)
综上所述,这篇文章的数据与之前发现的Nav1.7和Nav1.8异构体所具有的在痛觉细胞群体中优势表达的特性相一致。而这种组织型特征有望能够在体外培养的成年小鼠DRG神经元中长期维持。这表明我们所使用的培养方法能够为Nav1.7和Nav1.8的长期检测提供稳定的平台。而炎症递质所导致的DRG神经元慢性电生理活动变化的一系列实验,则突显了(MEA)表型筛选的有效性。
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