2021年12月，来自西奈山伊坎医学院等机构的科学家们在国际杂志BRAIN (IF 13.5）上发表了一篇题为 “Bacterial neurotoxic metabolites in multiple sclerosis cerebrospinal fluid and plasma” 的研究报告。让我们大家一起来参考下吧!
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研究背景及综述
人体和外界环境的交流与您的健康状况息息相关。而肠道作为这种活动的主要门户之一，正处在互动的最前线。比如，肠道微生物菌群失调是多种神经疾病发生的根源这个观点就得到了相当多研究的支持。就多发性硬化这种中枢神经病变而言，已有报道称病人和健康人群之间在肠道菌群的组成上截然不同。
类似于1型糖尿病及类风湿性关节炎等其它一些自身免疫疾病，大多数对该疾病的研究重点都在肠道和免疫系统之间的互作上。所以，我们看到有很多资料证明了细菌对于肠道相关免疫系统的作用。但除此之外，起码还有两种可能存在的微生物调控大脑健康的机制被提出，其中之一涉及微生物产生的毒素。相关研究聚焦在对这些进入血液从而到达脑实质的物质开展的检测和分析上。比如，人们已经在多发性硬化和视神经脊髓炎的病人体内，发现存在更高含量的由产气荚膜梭菌生成的ε毒素（简称ETX）。有报道说在一组患多发性硬化症的病人粪便中，能够检出这种毒素。而且该研究表明它能结合到大脑的血管上并最终促成了少突胶质细胞的死亡。
然而，我们仅能在小部分多发性硬化症病人体内找到ETX这种物质，所以应该还有其它的机制在发挥作用。大家都知道有益的肠道细菌对人类健康有贡献。比如它们能够促进人体对膳食色氨酸的吸收利用。而这个代谢通路在多发性硬化症病人身上又恰恰是失调的。正常情况下，色氨酸能够被代谢成为五羟色胺（一种神经递质）或者犬尿氨酸。而五羟色胺的生成是有益于生物体的。特别是对多发性硬化症而言，它的某些衍生物还能够直接结合到胶质细胞的芳香烃受体上从而发挥抗炎的作用。还有其它有益肠道菌的研究案例，比如普氏菌。它有助于生成短链脂肪酸，后者已被发现具有神经保护的作用。而它在人体内的含量在多发性硬化症这种病理条件下是有所降低的。
基于对上述两种潜在致病机制的综合考虑，我们认为不同肠道菌群有害和有益作用的失衡，不但会导致神经保护性代谢产物的耗竭，还可能会造成神经毒性化合物的积累。这种已经被观察到存在于多发性硬化症病患身上的失衡，就是本研究的首要假设。
团队设计了一个异种样本功能性实验来证明上述的假设：对同一病人在实施DMF治疗（抗炎药富马酸二甲酯，被FDA批准用于治疗成人复发型多发性硬化症）前后分别开展脑脊液采样，再将大鼠原代神经元培养物暴露于一系列的这类样本中进行神经毒性评估。随后对这组病人治疗前后的血浆和脑脊液样本开展代谢组学解析，以期发现那些具有丰度差异性的代谢物。通过后续的加权相关性网络分析（WGCNA），我们就能找到那些存在于病患的血浆和脑脊液样本中，其丰度和脑脊液的神经毒性相关的代谢物类群。用这种方法，我们鉴定出一些细菌源性的酚和吲哚类代谢物（如硫酸对甲酚pCS、硫酸吲哚酚IS及N-苯乙酰基谷氨酰胺PAG）。它们具有潜在的神经毒性并且能够为DMF治疗所部分清除。
为了更直接地去了解这些代谢物对于神经元功能的影响，本文的研究团队参考了上述神经毒性实验所使用的异种方案，在Axion公司的Maestro Pro高通量微电极阵列系统上进行了体外验证。
数据分析表明，这些被鉴定出来的神经毒性代谢物能够渐进地抑制大鼠神经元的自发放电活动，而且其程度与代谢物的浓度正相关。在长期暴露的条件下，我们还观察到了独立于线粒体失调和氧化应激的神经元轴突损伤现象。
相应地，在临床上我们能够也只能在接受了DMF治疗的复发缓解型多发性硬化（下文简称RRMS）病人群体中，观察到在核磁共振影像、残障及认知等方面的病理改善。这些病患体内的菌源性代谢物的水平与MRI测定的大脑皮质体积呈负相关，且与神经纤维丝蛋白轻链（一种已知的神经退行生物标志物）水平正相关。
综上所述，本研究在RRMS病人的脑脊液中发现了细菌的代谢产物。它们可能作为神经毒素，促成了外周和脑实质间的交互。我们相信，对于那些旨在获得神经退行性疾病新型治疗方案的研究计划而言，将重点放在代谢毒素上或将是成功的关键。
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菌源性代谢毒素神经毒性体外验证
首先，将人为调配的不同浓度的（5, 25 and 50 μM）代谢毒素鸡尾酒，加入到神经元培养物中。通过对SMI32（轴突标志物）染色后的共聚焦成像分析，我们观察到了长期暴露条件下剂量依赖性神经毒性的存在。随后为了进一步了解这些代谢物对神经元功能的影响，基于Maestro Pro微电极阵列系统，我们设计了如下的实验。
样本及数据记录方案：
种板：密度为6.0*104 cells/well，使用已包被的48孔微电极阵列测试板（Axion公司）。
样本：在大鼠胚胎发育第18天，获得海马及皮层原代神经元。体外分组培养（加药或不加药）到21天，上机检测。
加药：上述毒素鸡尾酒（5和50 μM两个浓度）、50 μM单个毒素（pCS、IS及PAG）、50 μM的富马酸单甲酯（即MMF，它是DMF的活性代谢产物。以了解DMF治疗对于神经元的潜在直接效果）
参数：平均放电率、每秒放电次数、每秒网络簇放电数量
采样：上机稳定5分钟后，连续采集10分钟的原始电信号数据。
分析：采用Axion公司的AxIS Navigator软件
实验结果及分析：
Figure 5C
Figure 5D-E
图5C呈现了相邻三个MEA孔的样本在某个具代表性的时间点的放电热图。对应于发放频率的高低，热图配色由红渐变过渡到黑。单一色点代表一个电极，每孔内共16个电极。在这里，您可以定性地快速判断神经元的功能性成熟度和药物作用的大致效果。
在图5D和E中，所有箱线图由代表极值的两根线条和四分位区隔线（从下到上对应于第25%、第50%和第75%三个数值）构成。分析图5D中的数据可知，相对对照组而言，在三个核心参数上我们都看到了由药物浓度决定的神经元功能降低现象。
为了弄清楚鸡尾酒混合物中每一个代谢毒素各自所起到的作用，我们充分利用了MEA测试实时无标记的特点，设计了图5E中的实验。在每个分组的样本中，先加入某一种代谢毒素，记录完数据后，再向同一样本补加鸡尾酒混合物中的另外两个成分，然后再次进行数据记录。经过分析，我们能得到和WGCNA实验相一致的结论：任何一个单一的菌源性代谢毒素都足以降低神经元的功能，而鸡尾酒混合物的协同作用又能进一步加强损伤的程度。大家要注意的重要一点是，这里用到的50 μM加药浓度是有依据的，并未超过之前报道的在尿毒症病人血液中所发现的同一物质临床病理浓度。
您还记得前文中提到过的本文“首要假设”吗？如果DMF治疗是通过重塑肠道菌群平衡来起效的话，它到底是通过促进神经保护还是减少神经毒素来发挥作用的呢？受益于Maestro Pro系统高通量的特点所支持的多重复多分组实验设计，我们得以开展如下的验证测试。
Figure 6D
Figure 6E
神经代谢毒素鸡尾酒被单独或与相同摩尔浓度的MMF混合后加入神经元培养物中后，样本的电信号被MEA系统记录下来，并与未加任何药物的对照组以及只加MMF的处理组进行平行比对和分析。从图6中的放电热图和箱线图中，我们都能发现：MMF并不会影响神经元的电活性，而两种药物共处理也完全无法逆转样本在三个核心参数上所表现出来的神经元功能降低现象。所以DMF治疗应该更多得是通过减少细菌毒素的产生来发挥作用的，而其本身的主要代谢产物并不具备神经保护的作用。
本文中的其它实验还证明，这三种菌源性代谢毒素能够穿过血脑屏障并具有直接神经毒性，而且它们在血浆和脑脊液中的相对浓度高度相关。这些数据综合起来，不但能够支持这些微生物酚类代谢物和吲哚类衍生物作为神经毒素的发现，而且还让我们得以推测它们的作用机理：即由肠道微生物产生后，通过血流和脑脊液，最后到达浅皮质层从而得以接触到中枢神经元。这些成果具化了我们对于脑-肠轴存在的猜测，并且具备潜在的转化医学价值。
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