研究背景

 
 
外周动脉疾病（PAD）是一种肢体动脉闭塞性疾病，阻碍血液流动到下肢。严重肢体缺血(CLI)是PAD的一种晚期形式，在糖尿病患者中可导致肢体丧失、坏疽和死亡。目前人们对促进其发展的潜在机制知之甚少。2022年9月哈佛医学院在Angiogenesis（IF 9.6）发表了他们对CLI发病机制的研究成果。
首先他们通过miRNA-Sequencing技术，对比了PAD的糖尿病人（小鼠）与正常人（小鼠）的血浆，发现PAD组与对照组在miR-375上存在显著差异。此后借助CytoSMART Omni箱内活细胞成像系统，对miR-375不同程度表达的细胞模型进行了一系列的体外功能测试实验。结果表明在体外内皮细胞中过表达miR-375能够促进血管生成并诱导内皮细胞迁移、增殖、发芽和血管网络形成，在人和小鼠中能显著抑制PAD向CLI的发展，而miR-375抑制则具有抗血管生成作用。
 
下面我们一起来看看哈佛医学院研究者如何借助CytoSMART Omni进行的体外功能测试实验吧~
首先建立miR-375不同表达的细胞模型：研究者对HUVECs细胞转染两组基因，分别是NSm (non-specific mimic) & 375m (miR-375 mimic) 组和NSi (non-specific inhibitors) & 375i (miR-375 inhibitors) 组。再分别进行如下功能测试实验:

 

1. 细胞迁移功能测试 | scratch assays 

 

实验方法：首先将ibidi划痕模具（ibidi Culture-insert）放入24孔板中，其次分别种入HUVECs 细胞（2x105 cells/孔），贴壁培养6-8h后将划痕模具取出，这样就制造出了宽度一致的划痕。随后将24孔板放置在Omni仪器上，实时观察划痕愈合情况（每小时成像一次，共监测16小时）。结果如下：

图B为NSm和375m组分别在0h和12h的划痕图像，白色虚线为软件自动识别的划痕宽度。我们可以直观地看到在12h，375m组其划痕已完全愈合，而NSm组细胞迁移速度较慢，划痕仍未愈合。图D则是对应表达抑制组（NSi和375i）的图像及分析结果。与图B结果恰恰相反，NSi组在12h其划痕已完全愈合，375i组则还未愈合。经过统计学分析，曲线下面积两者具有显著差异，验证了研究者miR-375过表达能够促进内皮细胞迁移的假设。

 

2. 球体出芽能力测试 | spheroid sprouting assay 

 

实验方法：分别将25μL含有1000 cells的matrigel胶滴滴入培养皿中过夜培养，待形成3D球体后将球体取出并种在含有collagen凝胶支架的24孔板中。随后将孔板放置在Omni仪器上，实时监测球体出芽过程（每6小时成像一次）。结果如下：

 

 

与细胞迁移测试实验结果相似，从图C中可以看到，375m组其球体出芽比率（出芽数量/球体数量）显著高于NSm对照组；相反地，375i处理组的球体出芽比率受到抑制，低于NSi对照组（见图E）。

 

 

3. 血管新生及网络形成测试 | network formation 

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实验方法：首先将Matrigel加入24孔板中，37℃孵育30分钟，以形成凝胶支架。然后分别将4组HUVECs以2x104 cells/孔的密度种在孔板中，之后放置在Omni仪器上，进行连续16小时的成管监测（每小时成像一次）。随后借助第三方分析软件来定量每个视野内血管的成管数量和长度。结果如下：
 

图F分别是375m和NSm组0,4,12小时Matrigel凝胶支架上HUVECs的成管图像。通过图像我们可以看到，375m组与NSm对照组相比，其内皮细胞成管数量和长度均显著提升，能够形成紧密的网络结构；而375i处理组则呈现相反的成管效果（见图G）。
 
 
 

总结

 
 
无论是2D细胞迁移，抑或是Matrigel支架上的血管新生，Collagen支架上的3D球体出芽测试，CytoSMART Omni箱内活细胞成像系统都能帮你轻松实现全过程监测，并自动做出定量分析，让您轻轻松松Get任何时间点的结果！
 

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