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脑类器官在研究人类大脑发育、脑疾病建模和开发新药方面有着巨大的潜力。携带病理特征的新鲜人脑组织是研究神经系统疾病更为可靠的模型，而其可获取性，可操控性以及低温保存神经活性却面临很多技术难题。

2024年5月13号，复旦大学脑科学转化研究院邵志成研究员团队在Cell Reports Methods杂志在线发表了题为“Effective cryopreservation of human brain tissue and neural organoids”的研究论文，报道了一种被称为MEDY的全新脑类器官冷冻保存新技术，该技术在冷冻过程中能够保留脑类器官的复杂结构和功能活性，保留人脑组织的病理特征。

邵老师团队借助Maestro MEA平台评估了MEDY冷冻技术是否影响皮层类器官的神经网络功能（图4D）。数据显示，在对照组（未经冷冻处理的类器官）和实验组（MEDY处理过的类器官）中均能检测到同步放电（图4E-G）。并且实验组的放电频率（图4H）、120s内的电极活跃数量（图4I）、网络簇放电数量（图4J）与对照组相比，均未有显著差异。综上所述，MEDY 冷冻保存技术并未影响脑类器官的神经功能连接。

下面就让我们对文章再做一个总体的回顾吧!

 

MEDY冷冻复苏技术的建立及其应用

 

研究团队首先选择了多种在维持类器官形态完整性、减少神经元死亡和保护轴突生长过程中起作用的试剂，包括甲基纤维素（Methylcellulose）、乙二醇（Ethylene glycol）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、海藻糖（Trehalose）、葡萄糖（Glucose）、蔗糖（Sucrose）和脯氨酸（Proline）等，通过不同浓度梯度，初步筛选出对类器官有一定保护作用的试剂甲基纤维素、乙二醇和PVP作为低温保存介质组分的候选试剂。为了进一步提高冷冻保存的效率，研究团队测试了不同冷冻保存介质组合并添加ROCK抑制剂Y27632后对类器官的冻存保护效果进行检测，结果表明4种组合冷冻剂都极显著地解决了类器官复苏后出现大量碎片的问题。通过对复苏后类器官轴突生长状态、神经元生长状态以及凋亡比例的对比分析，最终确定了1%甲基纤维素 + 10%乙二醇 + 10% DMSO + 10 μM Y27632 （MEDY）作为脑类器官的最佳冷冻保存剂 （图2）。

 

 

图2：不同冷冻保存介质对复苏后脑类器官的影响

 

进一步，通过改进复温流程，以及复苏后ROCK抑制剂预处理步骤，最终建立了脑类器官冻存复苏新方法。改进方法复苏后的神经类器官保留了细胞多样性、细胞组织结构以及神经元功能活性（图3）。

 

 

图3：MEDY保留脑类器官的细胞多样性、

功能结构以及功能活性

 

然后，研究团队将长期培养的大尺度脑类器官进行MEDY冷冻复苏，发现其对成熟的类器官依然起到冷冻保护作用。此外，该MEDY技术可以更广泛地应用于多种脑区域特异性类器官，包括背/腹侧脑、脊髓、视神经类器官和癫痫患者源性脑类器官。同时，MEDY可用于3D人脑组织的低温保存，解冻后仍可保留其病理特征。最后，研究团队通过转录组学分析发现，MEDY通过抑制内质网介导的细胞凋亡途径从而保护突触功能，实现在低温状态下对脑类器官的保护作用。

 

综上所述，该研究能够在将来显著减少了神经类器官的制备时间和成本，并能维持活体人脑组织的病理特征，便于各种神经类器官和活体脑组织的大规模存储，促进脑科学基础研究、神经类器官移植治疗和药物评估与筛选。

 

本文引用自“复旦大学脑科学转化研究院“公众号。