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研 究 摘 要

     神经元发展出“神经振荡”的过程与细胞和组织成熟过程类似，都受到遗传编程的调控。最近，来自加州大学圣地亚哥分校的Muotri教授团队，就利用人类基因组中内在编码程序开发出了一种“半引导”方式获得皮层类器官。皮层特征的这种转录、细胞和组织进化被认为遵循由遗传学定义的固定发育轨迹。与其它引导方案相比，本文介绍的方法具有较少的诱导和分化步骤，但仍然保留了神经营养因子（如BDNF及NT-3）的使用，同时允许一些先天的遗传编程来驱动类器官发育，并保证了细胞类型的多样性，使其最终被成功地引导到皮层命运。(编者按：类器官发育相关的论述和方法请参阅原文)。在这个过程中，他们借助Axion MEA平台对这些类器官进行了电生理功能分析。结果发现，它们已经足够成熟，其发放特征类似于在早产儿脑电波中观察到的“神经振荡”。因此，这种方式得到的类器官有潜力模拟人脑发育的电生理特性，可被用于探索神经发育和退行性疾病的新特征。

      相较于传统无引导方式，他们开发的这种“半引导”方法分化步骤更少，在缩短了诱导周期的同时还保留了样本的细胞类型多样性和疾病建模的可重复性。经验丰富的技术人员按照这个步骤仅需1个月左右即可获得有功能的类器官，还可在此基础上选择是否继续培养、电生理记录和AAV病毒转导等拓展实验。以上成果于2024年9月发表在 Nature Protocols上(IF 13.1)。

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应用方向

 

 

      研究者们可以利用这种“半引导”方式制备的类器官来开展（1）皮层相关神经疾病（2）比较多种培养方法的可重复性与有效性（3）神经环路等相关研究。

      事实上，Muotri教授团队已经成功地使用这个方法建立了自闭症和其它神经发育障碍类器官模型。比如酒精暴露对胎儿神经发育的影响、药物筛选以减轻寨卡病毒对胎脑的感染、人类和尼安德特人之间的神经发育差异、类器官-机器人集成界面中的学习机制、抗抑郁药物对神经发育的影响以及其他遗传疾病模型等。这种方法已经得到了同行们的认可，作为一个好用的工具将帮助科学家们深入开展神经生物发育、疾病和药物测试等研究，覆盖从罕见神经病理学到太空中发育中的新皮层如何受到影响等多个科研领域。

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MEA 部分介绍

皮层类器官电活动结果分析

Fig2.a~d 皮层类器官电生理检测流程及结果

a)皮层类器官在MEA多孔板上的图片。比例尺=1 mm。

b)类器官电生理信号分析示意图。黑色背景图片为神经元发放典型波形图。原始MEA Raw数据经highpass/lowpass filter导出后分别统计population spike number和 LFP voltage随时间变化图。神经网络同步放电则由黄色高亮表示。

c)与2D神经元相比，皮层类器官展现出更强且持续增加的平均放电率（类器官 n=8，2D神经元 n=12 ± s.d.）。插图：2D和3D培养物分化12周（从第8-20周）放电频率的相关性统计，反映出类器官重复之间的变异性比2D样本更小.

d)在皮层类器官发育第2-8月网络同步放电的population (pop.) spiking 和LFP的波形图。每个叠加的trace表示同一样本覆盖的不同电极在同一时间内的记录到的单个发放。

e,f)模型预测的皮层类器官发育时间，及其与实际发育时间之间的Pearson相关系数

所需试剂

准备MEA板(2天)

• 1. 使用1ml PLO溶液（100 μg/mL）予37℃ 5%CO2培养箱中包被6孔MEA 板过夜。

• 2. 吸弃PLO溶液。随后使用超纯蒸馏水或dPBS彻底冲洗孔≥2次以去除多余的PLO溶液。

• 3. 使用1ml Laminin mouse protein（10 μg/mL）予37℃ 5%CO2培养箱中包被上述6孔MEA 板过夜。

类器官种板（＜30分钟）

• 4. 挑选状态良好的类器官样本。1~2个月龄的类器官（半径200-400 μm，且有明显可见的神经花环结构）种板效果最佳。

  请注意：避免选用没有神经花环的类器官，因为它们可能分化不充分，并且其自发电活动可能更类似于神经球而不是皮层类器官。≤2个月的类器官可能没有可见的神经花环结构，因此确认其存在以后接种。

• 5. 在加入类器官之前吸出Laminin mouse protein溶液，无需冲洗。

• 6. 将两至三个类器官放入各孔，6孔板中每孔加入2mL 神经成熟培养基(neural maturation culture medium)。

  请注意：如果需要比较不同细胞系或者处理条件，那么每孔接种类器官数量应相同。

• 7. 使用剪过的p1000吸头，将用于接种的类器官转移到15 mL锥形管中，然后上下吸打使类器官表面的少量细胞松动脱落。这一步仅针对非常大 （>1 mm） 的类器官，目的是通过轻柔吹吸在类器官表面形成更大的附着表面。

  请注意：只需上下吸打两到三次即可，不要破坏类器官完整性。

• 8. 旋转MEA板，借助液体流动使样本移动至每孔中央区域，位于电极阵列上或直接靠近电极阵列。

  请注意：类器官不需要完全位于电阵列正中间，但至少要靠近电极。

• 9. 小心地将MEA板放置在37℃ 5%CO₂环境的培养箱中。一周内不移动MEA板且不进行换液操作，防止对类器官贴附造成影响。

更换培养基（每周一次）

• 请注意：使用5或10mL移液管，以最慢的速度同时仅施加一半的压力进行换液。动作幅度尽可能小，减少对样本的震动。

• 10. 使用M2神经元成熟培养基在MEA板上培养类器官至2个月大（总培养年龄）。每周更换培养基一次或两次，具体取决于培养基消耗量。

• 11. 类器官2个月后，开始使用完整的BrainPhys培养基(BrainPhys supplemented with SM1)进行半换液。每周一次，或根据培养物的消耗量进行更换。每周更换培养基的次数不要少于一次。

测量类器官电活动（约20min）

• 12. 类器官培养至2.5-3 个月开始，会表现出可检测的自发电活动。在类器官更换培养基后24小时后再进行记录。

• 13. 启动Axion Biosystems Maestro Pro设备，并预热约10分钟。

• 14. 将MEA板从培养箱转移到Maestro Pro设备中平衡3-5分钟。

• 15. 可以在AxIs Navigator采集软件设置记录Spike、Burst、LFPs等数据。编者按：请务必记录原始raw格式数据，后期所有的分析参数都可以由原始raw数据生成。

• 16.根据实验的需要，单次进行3~10分钟的记录。录制 1 分钟会生成约1Gb的数据。

  请注意：定期备份数据。

MEA分析参数

电活动相关参数可用于比较不同处理条件下细胞系发育过程、基因突变的神经元电活动差异。

• 17. 在记录和分析时检查波形形状，并排除掉噪音信号。图2b为一个典型的神经元放电波形图，去极化时出现低于基线的尖峰，然后快速复极化时出现高于基线的尖峰，最后神经兴奋完成波形归于基线。左上角白色数字代表spike的峰值电位值。
  18. 使用Axion的AxIS分析软件统计Spike和Burst的数量及频率，并生成光栅图。
   
  神经震荡相关参数

• 19. 使用自定义MEA分析代码分析LFP数据中新出现的神经振荡，代码登录https://github.com/voytekresearch/OscillatoryOrganoids/blob/master/organoid_EEG_age_regression.ipynb获取。简而言之，使用 AxIS 软件adaptive threshold crossing并将阈值设置为≥噪声标准偏差的5.5倍来筛选Spike尖峰。将≥5 spike/min的电极定义为活跃电极。设置单个Burst中最少拥有5个spike，且最大inter spike interval（ISI，相邻Spike时间间距）为 100 ms。每个孔中Network Burst定义为在同一ISI下检测到≥10 spikes，并且至少需要25%的活跃电极参与。使用20 ms的cross-correlogram同步窗口计算synchrony index。

END